Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

та расщепления субстрата и определением потребности в ионах магния. По мере накопления информации о типах построения узнаваемых участков выявилась определенная гетерогенность этой группы ферментов. Так рестриктазы, узнающие ассимметрическую последовательность нуклеотидов и расщепляющие ДНК в стороне от нее, обозначены IIS [364]. Закономерно вставал вопрос о том, что еще большая гетерогенность могла бы быть обнаружена при изучении других дифференцирующих признаков, например, структурной организации и реакции на другие кроме ионов магния кофакторы (АТФ, Адо-мет).

В последнее время были проведены эксперименты, давшие положительный ответ на поставленные вопросы и позволившие выявить ферменты нового типа [43, 288, 289]. Эти ферменты —

8

Характеристика ферментов рестрикции — модификации [417]

Таблица 1

Тип п

III

Активности рестриктазы и метилазы

Структура белка

Кофакторы, необходимые для рестрикции

Кофакторы, необходимые для метилирования

Соотношение реакций расщепления и метилирования

Узнаваемая последовательность нуклеотидов

Место расщепления

Место метилирования

Энзиматическая оборачиваемость рестриктазной реакции

Транслокация ДНК перед расщеплением

Один многофункциональный фермент

3 различные субъединицы

Адо-мет, АТФ, Mga+ Адо-мет, (АТФ, Mg2+)* Взаимоисключающие

Прерывистая нуклеотид-иая последовательность; ие имеет вращательной симметрии второго порядка

Предлоложительно случайное, по меньшей мере 1000 нуклеотидных пар в сторону от узнаваемой последовательности нуклеотидов

Узнаваемая последовательность нуклеотидов Нет

Да

Отдельные ферменты (эндонуклеаза и метилаза)

Простая (одна или несколько идентичных субъединиц)

Mg2+

Адо-мет

Отдельные активности

Короткие последовательности, состоящие из 4— 8 нуклеотидов, в основном с вращательной симметрией второго пор.ядка

В основном внутри узнаваемой последовательности нуклеотидов

Узнаваемая последовательность нуклеотидов Да

Нет

Один бифункциональный фермент, обладающий рестриктазной и метилазной активностями

2 различные субъединицы

АТФ, Mg2+, (Адо-мет) * Адо-мет, (АТФ, Mg2+)*

Возможно одновременное проявление рестриктазной и метилазиой активностей

Нуклеотидная последовательность либо вообще не имеет вращательной симметрии второго порядка, либо имеет некоторые ее элементы

24—26 нуклеотидный пар в стороне от узнаваемой последовательности нуклеотидов

Узнаваемая последовательность нуклеотидов Да

Нет

«о »-не

Является абсолютно необходимым, стимулирует энзиматическую реакцию.

Есо57 I и Gsu I по своей структурной организации и (или) эн-зиматическим свойствам не могут быть отнесены ни к одному из известных трех типов ферментов рестрикции модификации. Оба фермента узнают гексануклеотидные последовательности с некоторыми элементами вращательной симметрии второго порядка: Gsu I—5'CTGGAG и Есо57 I—5'CTGAAG. Обсуждаемой симметрией обладает последовательность 5'СТ—AG, характерная для участков, узнаваемых обоими ферментами. Gsu I и Есо57 I расщепляют ДНК за пределами узнаваемых гексанук-леотидов сходным образом через 14 и 16 нуклеотидов в разных цепях ДНК. По этим признакам рассматриваемые ферменты не являются уникальными среди других рестриктаз. Их отличия от остальных рестриктаз были обнаружены в ходе исследования кофакторных потребностей и структурной организации белков. Оказалось, что наряду с абсолютной потребностью в ионах магния для проявления действия Gsu I и Есо57 I, что является характерным для рестриктаз всех известных типов, эти ферменты активируются Э-аденозил-Ь-метионином (Адо-мет) и никак не реагируют на присутствие в реакционной смеси АТФ. Повышение активности Gsu I за счет добавления Адо-мет было ощутимым и давало двухкратный ее прирост. В отношении Есо57 I этот эффект проявлялся в примерно 100-кратном увеличении активности фермента. Для Gsu I характерен полный гидролиз ДНК по всем узнаваемым участкам вне зависимости от присутствия Адо-мет. В случае Есо57 I исчерпывающего специфического фрагментирования не наблюдалось. Это, возможно, объясняется тем фактом, что даже в электрофоре-тически гомогенном препарате фермента содержится Есо57 I метилазная активность, чего не наблюдается даже в невысоко очищенных препаратах RGsu I.

Молекулярный вес Есо57 I, определенный методом гель-фильтрации и электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (в присутствии додецилсульфата натрия), равняется 104 000 и 108 ООО D соответственно. Совпадение молекулярной массы нативной и денатурированной формы Есо57 I указывало на то, что фермент состоит из одной полипептидной цепи. Отсутствие четвертичной структуры описано только для рестриктаз II типа [31, 54, 174, 210, 229, 290]. Согласно этому критерию к II типу следовало бы отнести Есо57 I. Однако, как уже отмечалось, разделить эндонуклеазную и метилазную активности не удалось, что указывало на объединение этих активностей в одну полипептидную цепь.

Рассмотренные структурные характеристики рестриктазы Есо57 I делают ее отличной от всех известных изученных в этом отношении рестриктаз. По другим признакам, таким как расщепление ДНК за пределами узнаваемого участка, неполное фрагментирование субстрата, стимулирующий эффект Адо-мет,

10

Есо57 I напоминает ферменты рестрикции III типа, но отличается от них отсутствием потребности в АТФ.

Рестриктаза Gsu I еще больше отличается от ферментов

III типа. В первую очередь это выражается в том, что она дает исчерпывающий гидролиз субстрата, чем напоминает рестриктазы II типа, однако от последних ее отличает стимулирующий эффект Адо-мет.

Из вышеизложенных данных также следует, что Есо57 I и Gsu I, несмотря на сходство их субстратной специфичности, тоже отличаются друг от друга.

На основе проведенных исследований было предложено рассматривать Gsu I и Есо57 I как представителей новых классификационных типов ферментов рестрикции и отнести их к

IV — Есо57 I и V — Gsu I типам [43, 289]. На данный момент эти типы по глубине характеристики уступают остальным (I—III), что указывает на необходимость проведения дополнительных исследований. Особенно это замечание относится к Gsu I.

Рассмотренные выше публикации представляют собой первые примеры более углубленного подхода к изучению кофак-торной потребности рестриктаз, что позволило выявить ферменты нового типа. Расширение аналогичных исследований позволило бы ответить на вопрос о распространении обнаруженных типов рестриктаз или наличии новых. Изучение этих вопросов имеет не только теоретический, но и практический интерес, так как таким путем могут быть найдены, например, способы активации специфических эндонуклеаз, что в конечном счете можно рассматривать как увеличение выхода целевого фермента, предназначенного для применения в качестве аналитического реагента.

В контексте настоящего обзора отдельного обсуждения заслуживает субстратная специфичность и характер расщепления ДНК сравниваемыми типами рестриктаз — показатель, имеющий наибольшее практическое значение, если задаться целью их использовать в каче

страница 3
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2019)