Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

специфической нуклеотидной последовательности ДНК, обуславливающий уникальную специфичность рестрикционной эидоиуклеазы. Установлено, что в основе процесса узнавания лежит взаимодействие между определенными группами белка и нуклеотидными основаниями, расположенными в главном желобе. Показано, что между аминокислотными остатками Glu144, Arg145, и Arg200 и пуриновыми основаниями гексануклеотида 5'GAATTC образуется ряд водородных связей, обеспечивающих специфическое

7-5933 6

97

взаимодействие ДНК и фермента (ом. рис. 1). Аминокислотные остатки, учавствующие в образовании водородных связей с нук-леотидными основаниями, расположены на симметричных субъединицах рестриктазы EcoR I таким образом, что Arg200 локализован на внешней, a Arg145 и Glu144 на внутренних а-спира-лях, проникающих в главный желоб ДНК. Аминокислотный остаток Arg200, расположенный на внешней а-спирали каждой

Атд ZOOfi

Arg200л

Рис. 1. Схематическое изображение водородных связей, образующихся при взаимодействии рестриктазы EcoR I с основаниями узнаваемой последовательности нуклеотидов

из субъединиц, взаимодействует с гуаниновым основанием, образуя 2 водородные связи, а аминокислотные остатки Arg145 и Glu144 этой же субъединицы образуют 4 водородные связи с адениновыми основаниями олигонуклеотида 5'ААТТ. Аминокис-

ЗТТАА

лоты Arg145 и Glu144 одной субъединицы взаимодействуют с парами соседних адениновых оснований локализованных на разных нитях ДНК (см. рис. 1). Следует отметить, что аминокислотные остатки Arg145 и Glu144 образуют поперечные водородные связи с соседними аденинами как бы «сшивая» их при помощи водородных связей.

98

Таким образом аминокислоты отдельно взятой субъединицы, участвующие в «узнавании», образуют водородные связи с основаниями согласно схеме представленной ниже (это упрощенный вариант схемы, рис. 1):

5' 6

j* С

Агдл

А А г г с

\ 1

61ил

1—г

т т 1 f л

ч?

fr*-*) fi еубъввиница.

Таким образом между аминокислотными остатками Arg200, Arg145 и Glu144 одной субъединицы и 5-тью нунклеотидными основаниями участка узнавания, образуются 6 водородных связей. Аналогичные взаимодействия симметричной субъединицы с субстратом приводит к образованию еще 6 водородных связей. Реализация обсуждаемых водородных связей с ДНК в обычной В-конформации невозможно, однако, как уже отмечалось выше, в результате взаимодействия ДНК с белком, происходит частичное расплетение нитей ДНК, приводящее к сближению нуклеотидных оснований АА и ТТ, что и приводит к появлению-возможности образования поперечных водородных связей с соседними аденинами. Таким образом, между аминокислотными остатками Arg200, Arg145 и Glu144, расположенных на обеих субъединицах рестриктазы, и гексануклеотидов 5'GAATTC образуется 12 водородных связей, которые обеспечивают специфичность связывания рестриктазы EcoR I с канонической нуклеотидной последовательностью. Следует отметить, что в этом случае наблюдается «насыщение по водородным связям» между олиго-нуклеотидом 5'GAATTC и аминокислотными остатками, участвующими в узнавании.

На основе механизма узнавания специфической последовательности ДНК рестриктазой EcoR I посредством водородных связей, удалось объяснить «релаксированную» специфичность рестриктазы EcoR I и иерархию «вырожденных» последовательностей, служащих узнаваемым участком, в отношении скорости их расщепления. Замещение любого из оснований в канонической EcoR I последовательности неизбежно приводит к уменьшению числа водородных связей с ферментом. В случае проявления релаксированной активности рестриктазы разные последовательности, являющиеся производными канонической,

99

расщепляются с неодинаковой скоростью [233]. Было установлено, что существует следующая градация (иерархия) скоростей гидролиза субстрата в зависимости от природы основания в первом положении последовательности 5'GAATTC: G^A> >Т>С (5'GAATCC расщепляется быстрее чем 5'АААТТС и т. д.). Эта закономерность находит свое объяснение в зависимости между замещениями в канонической последовательности и снижением числа водородных связей с ферментом. Замещение аденина на гуанин приводит к исчезновению одной водородной связи То же самое наблюдается в случае замены гуанина на тимин. Поэтому последовательности 5'АААТТС и 5'ТААТТС смогут образовать с белком не более 11 водородных связей. Цитозин вообще не способен образовывать водородные связи. Поэтому последовательность 5'СААТТС образует с белком только 10 сайтспецифических водородных связей.

Учитывая быстрый прогресс в конструировании продуцентов рестриктаз методами генной инженерии, использование которых позволяет выделить необходимые количества целевого белка и установить его первичную структуру, а также большой интерес к исследованию механизмов специфического белок-нуклеинового взаимодействия, следует предположить, что в ближайшее время появятся новые работы, посвященные изучению обсуждаемого вопроса. В результате будет получен ответ на вопрос о существовании или отсутствии универсального специфического кода узнавания (взаимодействия) между белком и ДНК. Выявление такого кода способствовало бы конструированию рестриктаз заданной специфичности методами белковой инженерии.

9. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА ФЕРМЕНТОВ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ

Методом генетического анализа в исследованных немногочисленных случаях было установлено, что система хозяйской специфичности в случае ферментов II типа контролируется двумя (г и т) генами [64, 413]. Также в этих опытах была показана нежизнеспособность штаммов с генотипом r+m~ [64, 413], что вполне понятно учитывая функцию метилазного компонента в системе двух сопряженных ферментов. На этом же этапе исследований было установлено, что гены ферментов рестрикции-модификации могут быть локализованы на плазмидах [167, 389]. В настоящее время предполагается, что некоторые гены rm расположены в бактериальных хромосомах [180, 194, 306, 350, 363, 389], хотя строго говоря этот вывод экспериментально подтвержден только в случае BsuR I [375]. Имеется пример фаговой локализации генов, контролирующих структуру ферментов RMEcoP I, относящихся к III-вму типу [184, 351]. В от-

100

ношении ферментов II типа такие данные получены в случае ферментов, кодируемых ДНК вирусов, размножающихся в эукариотических клетках [271].

Бактериофаги SPR, ФЗТ, Qll Bacillus subtilis содержат гены метилаз не входящих в системы R—М и модифицирующих одновременно два или три типа специфических нуклеотидных последовательностей ДНК. Показано, что MBsuSPR модифицирует цитозин в трех последовательностях— 5'GGCC; 5'ССт GG; 5'CCGG, a MBsuВ клетках Е. coli также имеются две метилазы, не входящие в

страница 33
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.09.2019)