Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

1972, 112, 1275—1279.

414. Yoshioka H., Nakamura H. et al. «Agr. Biol. Chem.*, 1983, 47, 2871—2879.

415. Youssoufian H., Hammer S. M. et al. «Ргос. Natl. Acad. Sci. USA*, 1982, 72, 2207—2210.

416. Youssoufian M., Mulder C. «J. Mol. Biol.*, 1981, 150, 133—136.

417. Yuan R. «Annu. Rev. Biochem.*, 1981, 50, 285—315.

418. Yuan R., Bickle T. A. et al. «Nature», 1975, 256, 556—560.

419. Zinoviev V. V., Gorbunov J. A. et al. «FEBS Lett.*, 1983, 154, 282—284.

Часть II. МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕСТРИКТАЗ

Значительная часть исследований, в особенности на первом этапе изучения рестриктаз, была посвящена поиску, очистке и характеристике специфичности рестриктаз. Это направление исследований не потеряло своей актуальности и в настоящее время и стимулируется как желанием обнаружить новые по специфичности ферменты с целью их дальнейшего применения в качестве аналитических реагентов, так и необходимостью изучения таких фундаментальных вопросов как закономерность распространения рестриктаз и вариабильность их субстратной специфичности. В настоящем разделе будут рассмотрены некоторые методические аспекты решения обсуждаемых, а также ряда других задач (определение активности, клонирование генов рестрикции-модификации).

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ РЕСТРИКТАЗ

С задачей определения активности рестриктаз приходится сталкиваться в самых различных экспериментах: в опытах по поиску продуцентов, изучению влияния условий культивирования на содержание целевых ферментов в биомассе, их очистке и характеристике каталитических свойств. Специфической чертой области энзимологии, посвященной изучению рестриктаз, является тот факт, что в подавляющем большинстве вышеуказанных опытов проводится в основном только качественная оценка активности исследуемых ферментов. Если в случае поиска продуцентов рестриктаз это является оправданным, то в ходе их очистки вынужденным. Последнее обстоятельство объясняется отсутствием простых количественных методов определения активности специфических эндонуклеаз.

Ряд предложенных и апробированных для определения активности рестриктаз методов в настоящее время имеет только историческое значение. В первую очередь это замечание относится к биологическим методам, примеры применения которых имеются не только в случае рестриктаз I и III типов [93, 112, 140] но и II типа [158,271]. Этим методом, основанным на определении снижения трансфекционной способности фаговых ДНК, обработанных in vitro исследуемыми ферментами, характерна трудоемкость, низкая точность и большая продолжительность, обусловленная в первую очередь временем, необходимым для проявления биологической активности фагов (лизис клеток). Ультрацентрифугирование и визкозиметрический метод, использованные для определения активности нескольких первых специфических эндонуклеаз [158,182,253], тоже отличают-

126

ся трудоемкостью, а в случае центрифугирования и большой продолжительностью.

Вышеуказанные методы не нашли широкого применения и потому, что был разработан более простой и более информативный способ определения активности рестриктаз, основанный на разделении продуктов реакции — фрагментов ДНК, различающихся по длине, электрофорезом в агарозных гелях. В первых вариантах применения этого метода визуализацию разделенных фрагментов ДНК проводили авторадиографией [1821 или путем окрашивания акридиновым оранжевым [271]. Апробация с этой целью этидиума бромистого, дающего при освещении гелей УФ светом флуоресцирующие зоны ДНК, Шарпом с сотр. [241] продемонстрировала высокую чувствительность обсуждаемого способа детекции ДНК и способствовала повсеместному применению электрофоретического метода для оценки активности рестриктаз.

Электрофоретический метод отличается простотой выполнения и избирательностью. Это единственный из известных методов оценки активности рестриктаз, в результате применения которого имеется возможность судить о характере расщепления субстрата — каждая специфическая эндонуклеаза генерирует уникальный набор фрагментов ДНК субстрата, который после проведения электрофоретического их разделения дает определенный, характерный для этого фермента набор зон в геле. Рассмотрение таких картин позволяет судить не только о наличии рестриктазы в исследуемом растворе, но отчасти и об ее активности и субстратной специфичности. Последнее свойство обсуждаемого метода оказывается очень важным в тех случаях, когда в фракционируемой смеси содержится более чем одна рестриктаза. Кроме того, снижение интенсивности и четкости зон ДНК позволяет судить о наличии в фракциях неспецифических нуклеаз. Однако, электрофоретический метод наряду с отмеченными достоинствами имеет существенный недостаток, выражающийся в том, что количественное определение активности исследуемых ферментов проводится путем оценки перехода: неполное расщепление—полное расщепление субстрата. Для того, чтобы идентифицировать этот переход, необходимо проводить обработку субстрата различными количествами фермента, что значительно увеличивает число анализируемых проб. Если учесть, что в ходе хроматографической очистки такой оценке подлежат многие десятки фракций, трудоемкость количественного определения активности рестриктаз электро-форетическим методом в таких опытах становится очевидной. Однако использование именно этого метода оправдывает себя в случае определения активности конечного препарата, предназначенного для применения в качестве аналитического реагента. В этом случае необходимо знать количество фермента, обеспечивающее исчерпывающее специфическое фрагментирование

127

субстрата на заданное время. Электрофоретическая единица активности (э.е.а.), оцениваемая именно по этому показателю, такую информацию дает.

Стремление создавать количественные методы, основанные на оценке кинетики рестриктазной реакции, реализовывалось апробацией нескольких альтернативных приемов. В частности, как дальнейшее развитие электрофоретического метода, было предложено анализировать кинетику накопления в реакционной смеси конечных и промежуточных продуктов гидролиза субстрата. В качестве субстратов, в зависимости от характера решаемых задач, были использованы линейные ДНК молекулы, содержащие ограниченное количество потенциальных точек разрыва [2541, или кольцевые, содержащие один участок, узнаваемый исследуемым ферментом [106, 107]. Для оценки количества ДНК в зонах было применено прямое денситометрирова-ние гелей [254], их фотонегативов [271,254] или измерение радиоактивности [107]. Обсуждаемый подход оправдал себя в опытах по определению некоторых кинетических параметров реакций, катализируемых исследуемыми рестриктазами.

Рейсер и Юан [214] предложили использовать в качестве субстрата кольцевые ДНК молекулы фага % (кольца Херши). Для разделения субстрата и продуктов рестриктазной реакции их раствор пропускали через нитроцеллюлозные фильтры. Свойство нитроцеллюлозы в определенных условиях связывать только кольцевые ДНК молекулы позволило отделить продукты реакции и субстрат. Последующее измерение количества связанной с фильтрами радиоакт

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)