Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

ервоначальные цели, предшествовавших открытию рестрикционных эндонуклеаз II типа, находим эксперименты, посвященные изучению распространению и характеристики СХС в различных таксономических группах микроорганизмов [24, 25, 186, 242], механизмов ограничения развития фагов R плазмидами [8, 129, 300] и факторов, влияющих на исход опытов по фаготинированцк> [258]. В некоторых случаях первопричиной таких опытов было стремление выбрать не обладающие СХС базовые штаммы некоторых новых объектов с целью их использования как реципиентов рекомбинантных молекул ДНК в опытах по генетической инженерии. Примером таких работ является изучение наличия и специфичности систем рестрикции—модификации в. штаммах стрептомицетов [6] и цианобактерий [91].

Указанные выше исследования послужили предпосылкой для открытия рестриктаз II типа; EcoRI и EcoRII из штаммов-Е. coIiRY13 и R245 соответственно [330, 301], EcoRV [28] — Е. coli J62pLG74 [8], ЕсоСК [1] — Е. соНСК [25], Sso47 н Sso47 II [18]— Shigella Sonnei47 [25, 26], Рае37 I [119] — Pseudomonas aeruginosa [129], Sau3A I и Sau96I в штаммах Staphylococcus aureus3A [264] и 96 [265] соответственно, BsuMI [136] BsuRI [59] в штаммах Bacillus subtilis 168 [242J и R [275] соответственно, Bst I [70] из Bacillus stereothermophil-lus 1503—4R [69], BamNI [243] и BamHI [296] в штаммах Bacillus amyloliquefaciens N и H [242] соответственно, Shy I [287] — Streptomyces hygroscopicus 0477 [24], Sgr II [20] — Streptomyces griseus Kr20 [6], NspB I и NspB II, NspH I и NspH II из Nostoc sp. В и H соответственно [91], Avr I и Avr II [216] из Arabaena variabilis [79], ScrF I [95] — Streptococcus craemoris F [81], MviV2 I и MviV2 II из Mixococcus virescens V2 [186]. Этим списком, включающим 25 наименований, практически исчерпывается перечень ферментов, для которых удалось четко определить последовательный ход экспериментов, начавшихся с выявления систем рестрикции-модификации биологическими методами и

9*

131

завершившихся идентификацией специфических эндонуклеаз биохимическими методами. Учитывая тот факт, что в настоящее время известно более 1000 рестриктазы, вклад биологических методов в пополнение списка этих ферментов следует признать незначительным. Причины этого явления скрываются в ограниченных возможностях обсуждаемого подхода в сфере целенаправленного широкомасштабного поиска специфических эндонуклеаз. Иллюстративной в этом отношении является работа В. Н. Крылова и А. Т. Карапетян [16], одна из немногих, где ставилась цель определить вероятность обнаружения новых вариантов рестрикции-модификации среди природных штамммов и оценить трудности и возможности таких исследований.

Поиск бактерий, обладающих СХС, был проведен среди 547 штаммов Е. coli, выделенный из сточных вод. В этих опытах в качестве тестерных были использованы 23 лямбдоидных фага. В результате проведенных исследований, заключавшихся в определении эффективности посева этих фагов на исследуемых штаммах, не удалось выявить ни одной культуры, проявляющей феномен рестрикции-модификации, хотя при первичной проверке из огромного числа комбинаций фаг-бактерия (23 фа-гаХ547 штамма < 12 ООО) литическое развитие наблюдалось только в 187 случаях. Однако, основной причиной ограничения роста фагов оказалось отсутствие их адсорбции на бактериальных клетках. Средняя вероятность как какого-либо лямбдоид-ного бактериофага из испытанной группы встретить адсорбирующий его микробный штамм в исследуемой выборке составила немногим более 2%.

Для продолжения опытов по поиску СХС была отобрана группа из 37 комбинаций фаг-бактерия (оставшихся после исключения из 284 давших адсорбцию 187 комбинаций, завершающихся литическим развитием фагов и 60, отличавшихся низким уровнем адсорбции). На отобранной группе проверялась возможность преодолеть ограничение роста при высоких множественностях инфекции. В результате этих исследований наблюдался лизис трех штаммов. Однако, как было показано, это было связано не с литическим развитием фагов, а с проявлением некоторых функций проникших в клетки молекул фаговой ДНК [16].

Таким образом, несмотря на то, что работа была проведена на многочисленной группе штаммов (всего 547) и тестерных фагов (всего 23), попытка поиска среди них культур, содержащих СХС, не увенчалась успехом. Авторами было выдвинуто предположение, что клетки обладают не одним механизмом подавления развития фагов, в том числе и отличающимися от рестрикции-модификации. Проявление этих механизмов не преодолевается множественной инфекцией и, таким образом, исключает возможность тестирования наличия СХС. Правиль-

132

ность этого предположения в одном случае была доказана. Для разделения гипотетических факторов ограничения развития тестерных фагов были получены рекомбинанты между 10-тью природными культурами и лабораторным Шг штаммом Е. coli. В двух рекомбинантах, отобранных при скрещивании одного природного штамма с лабораторным, удалось выявить наличие СХС, которая, согласно данным перекрестного тестирования к фага на штаммах, содержащих известные системы рестрикции-модификации, функционирующие в Е. coli. и исследуемым, оказалась новой.

Из данных рассмотренной работы [16] следует, что основным фактором, препятствующим тестированию наличия СХС в исследованных штаммах Е. coli, оказалось отсутствие адсорбции тестерных фагов. Это явление распространено и в других группах микроорганизмов. Так, в аналогичной работе, проведенной И. И. Никольской-Санович с соавт. [19, 25] из 872 штаммов шигелл было отобрано 100 культур, не давших размножения бактериофагов серии ДД. Оказалось, что в 98 случаях низкая эффективность посева была обусловлена отсутствием адсорбции. Проверка двух оставшихся штаммов Sh. sonnei 311 и Sh. sonnei 47 методом перекрестного титрования позволило выявить наличие в них СХС. Последующее изу-ние энзиматических основ СХС Sh. sonnei 47 реализовалось в открытии двух рестриктаз II типа — Sso47 I и Sso47 II [18].

Отсутствие адсорбции не исчерпывает разнообразия вариантов взаимодействия бактериальных вирусов и микробных клеток. Они иллюстрируют лишь одну сторону этого явления, а именно проявление клеточных защитных механизмов, фено-типически (по критерию отсутствия роста) иммитирующих рестрикцию. Однако, существует и другой вариант взаимодействия клетка—бактериофаг, который может иммитировать отсутствие СХС. Примерами таких механизмов является синтез ингибиторов [170, 171] и метилаз [76, 137, 191, 192, 276] кодируемых фаговыми генами, защищающих вирусную ДНК от действия рестриктаз II типа.

Отсутствие СХС может иммитироваться и в тех случаях, когда ДНК тестерных фагов не содержат сайтов, узнаваемых существующей в исследуемом штамме рестриктазой. Это явление представляет собой один из вариантов эволюционных адаптивных изменений бактериальных вирусов, призванных способствовать преодолению ими барьера СХС. Действие давления отбора в данном конкретном случае выражается в статистическом достоверном уменьшении числа или даже полной элиминации в фаговой ДНК последовательностей нуклеотидов, являющихся субстр

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)