Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

то рестриктазы, локализованные в периплазматическом пространстве клеток, могут быть переведены в раствор в результате осмотического шока, и успешно использовали этот прием в опытах по поиску продуцентов рестриктаз. Механическое разрушение клеток при помощи гомогенизатора Поттера было предложено Майером и Райхенбахом [179]. Эти исследователи сравнивали три различных метода разрушения клеток: ультразвуковую дезинтеграцию, осмотический шок и механический. Оказалось, что наиболее эффективным приемом в отношении выхода рестриктаз является обработка клеток ультразвуком. Осмотический шок и применение гомогенизатора Поттера дали выход соответственно на 40—60% и 20—40% ниже. Оказалось, что осмотический шок высвобождает рестриктазы только из грамотрицательных бактерий. По мнению авторов, механическое разрушение дает вполне приемлемые для опытов по поиску продуцентов рестриктаз результаты. Этот способ является менее трудоемким по сравнению с другими апробированными методами. Он успешно-

136

применен в случае проверки 120 штаммов скользящих бактерий на наличие специфических эндонуклеаз [179].

Бесклеточные экстракты культур, полученные после отделения обломков клеток путем центрифугирования, используются для тестирования рестриктазной активности либо непосредственно [179, 251], либо после частичной их очистки [104, 246, 258, 261]. С этой целью обычно используется ряд простых приемов, пригодных для быстрой обработки грубых экстрактов многих исследуемых штаммов. В работах, посвященных систематическому поиску специфических эндонуклеаз в штаммах Staphylococcus aureus [258] и культурах рода Bacillus [245], частичная очистка заключалась в высаждении нуклеиновых кислот стрептомицинсульфатом. В некоторых случаях подготовка образцов для анализа включала (дополнительно к удалению нуклеиновых кислот) стадию высаливания белков сернокислым аммонием [246].

Наряду с вышеуказанными, относительно простыми методами первичной обработки бесклеточных экстрактов, имеются примеры использования с этой целью и более сложных приемов. Так, в экспериментах по поиску рестриктаз в штаммах рода Proteus, грубые экстракты пропускали через биогель А 0,5 м и тестировали активность целевых ферментов в собираемых фракциях [104]. В аналогичных экспериментах, заключавшихся в проверке 147 штаммов бактерий, их бесклеточные экстракты пропускали через фосфоцеллюлозу [261] и тестировали рестриктазную активность в фракции, содержащие несор-бировавшие белки и элюате, полученном при помощи ступенчатой элюции связанных сробентом белков 1 М раствором КО. Трудоемкость последних двух приемов является очевидной.

Резюмируя рассмотренные выше литературные данные, следует обратить внимание на тот факт, что использование в ряде работ по поиску рестриктаз первичной очистки бесклеточных экстрактов, предшествовавшей проверке наличия специфических эндонуклеаз в исследуемых штаммах, возможно, не было оправданным. В цитированных источниках [104, 246, 258, 261] не имеется указаний, чем руководствовались авторы, выбрав путь тестирования частично очищенных препаратов. Было ли это вызвано невозможностью определения рестриктазной активности непосредственно в бесклеточных экстрактах или частичная очистка была введена в эксперименты без предварительных опытов? Если такие эксперименты не проводились, то в общем случае в ходе такой «слепой очистки» (неконтролируемой по активности целевого фермента) не исключена потеря целевых ферментов. Удаление нуклеиновых кислот стрептомицинсульфатом может сопровождаться соосаждением значительных количеств рестриктаз. Поэтому «слепое» использование этого приема для первичной очистки бесклеточных экст-

137

рактов исследуемых культур может в некоторых случаях имитировать отсутствие рестриктаз в них. Особенно это вероятно в случае низкого содержания целевых ферментов. Поэтому частичную очистку, как этап, предшествующий тестированию наличия специфических эндонуклеаз в исследуемых культурах, следовало бы использовать как дополнительный прием только в отношении бесклеточных экстрактов, давших отрицательный результат в ходе первичной проверки. Если такой результат был получен вследствие маскирования рестриктаз какими то факторами, присутствующими в бесклеточных экстрактах (например, нуклеазами), не исключено, что в некоторых случаях «слепой» очисткой удается от них освободиться и тем самым выявить искомую активность.

Пропускание бесклеточных экстрактов через фосфоцеллю-лозу [261] можно рассматривать как способ, позволяющий совмещать в одном опыте проверку наличия рестриктазной активности в бесклеточных экстрактах (фракция, содержащая не-сорбировавшиеся белки) и частично очищенных препаратах (элюат). К сожалению, авторы цитированной работы, открывшие 15 продуцентов рестриктаз в 147 проверенных таким способом штаммах, не указывают, где (в проскоке или элюате) и в каком соотношении ими были обнаружены рестриктазные активности. Отсутствие этих данных не позволяет оценить потенциальные возможности обсуждаемого метода в отношении совмещения в одном опыте проверки активности целевых ферментов в бесклеточных экстрактах и частично очищенных их препаратах.

С расширением объема работ по поиску ферментов рестрикции возникла необходимость в максимально упрощенных методах, позволяющих провести массовое тестирование проверяемых штаммов. Первыми такой методический прием предложили и разработали Уайтхед и Браун [294]. Эти авторы культивировали исследуемые культуры в 4 мл жидкой среды и собранную центрифугированием биомассу суспендировали в буферном растворе, содержащем 25% сахарозы, лизоцим и ЭДТА. После непродолжительной (2 мин) инкубации при 0°С к суспензии добавляли детергент Brij'-58, MgCl2 и выдерживали ее 15 мин при комнатной температуре. После этого клетки удаляли центрифугированием, а полученную надосадочную жидкость использовали для исследования на наличие специфической эндонуклеазной активности электрофоретический методом. Было показано, что предложенный метод оправдывает себя при тестировании представителей самых различных родов микроорганизмов: цианобактерии, грамотрицательных бактерий и бацилл. Вместе с тем он не является универсальным и дал отрицательные результаты в случае проверки Herpetosiphon •giganteus и Streptomyces. Авторы обсуждаемой работы связывают возможность тестирования представителей различных

138

таксономических групп со способностью используемого приема вызывать образование сферопластов микроорганизмов. Некоторые среди них обладают таким строением клеточной стенки, которая исключает возможность ее пермеализации используемым приемом.

Самым простым известным в настоящее время методом массового скрининга штаммов следует признать способ разработанный Белавиным, Дедковым и Дегтяревым [3]. Предложенный прием представляет собой упрощенный и усовершенствованный метод Уайтхеда и Брауна [294]. Основным различием между ними, позволяющим значительно снизить трудоемкость, является использование в качестве исходного материала биомассы отдельных колоний, выращенных на агаризованной среде. Отличия

страница 48
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.09.2019)