Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

групп рестриктаз, следует отнести к прогрессивным тенденциям препаративной биохимии этих ферментов. Их разработка и применение призвано способствовать выбору схем очистки новых рестриктаз, выявлению общностей и различий в хроматографическом поведении этих ферментов, что имеет не только теоретическое, но и практическое значение.

3.4. Возможные перспективные направления развития препаративной биохимии рестриктаз

3.4.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Учитывая большой и все нарастающий ассортимент ферментов рестрикции, перманентный поиск и выделение все новых рестриктаз, является очевидным, что усовершенствованию методов их выделения постоянно уделяется внимание. Появление методов высокоэффективной жидкостной хроматографии

160

(ВЭЖХ) и сорбентов, адаптированных к очистке нативных белков, тоже не осталось без внимания. Общеизвестно, что для ВЭЖХ характерна непревзойденная разделяющая способность и быстрота проведения хроматографического цикла. Препаративная биохимия ферментов рестрикции в большинстве случаев (особенно в случае выделения препаратов новых ферментов для определения их специфичности) характеризуется мелкомас-штабностью. Вышеизложенное, казалось бы указывало на исключительную перспективность применения ВЭЖХ для очистки рестриктаз. Однако, примеров этому пока немного. Три рестриктазы (Ban II, Sac I и Sph I) были очищены в двухстадийной схеме, где на втором этапе была использована Mono Q колонка в режиме ВЭЖХ [56]. На первой стадии, согласно предложенной методике, ферменты подвергались хромато-графическому фракционированию в режиме обычной жидкостной хроматографии, на разных для различных ферментов сорбентах. Разработанные схемы очистки были более простыми по сравнению с существовавшими для исследованных ферментов. Вместе с тем следует отметить, что к сожалению, в рассматриваемой публикации [56] не приводятся данные об относительных выходах рестриктаз на стадии ВЭЖХ, т. е. отсутствуют данные о потерях, что является немаловажной информацией, необходимой для оценки перспективности широкого применения тех или иных приемов выделения и очистки ферментов.

В последнее время в литературе появилось еще несколько примеров применения ВЭЖХ для очистки рестриктаз [204, 205]. Колонки Mono Q, Mono S, Polyarion SI фирмы «Фармация» использовались на последних стадиях очистки. Количественные данные характеризующие эффективность этих стадий в рассматриваемых публикациях отсутствуют.

Несмотря на немногочисленность публикаций документирующих применение ВЭЖХ для выделения рестриктаз, думается, что этот вариант хроматографии со временем займет подобающее ему место в этой области препаративной биохимии. Во многом это будет зависеть от разработки новых сорбентов. Вместе с тем уже сейчас имеющиеся данные о возможности за 20 мин хроматографии на колонке Mono Q получить 1—10 тыс. ед. вы-сокоочищенного фермента [56] должно было бы привлечь внимание исследователей, особенно занятых опытами по выделению и характеристике новых ферментов, где важно кратчайшим путем получить несколько сот единиц рестриктазы, пригодной по качеству для определения ее субстратной специфичности.

3.4.2. Новые методические подходы к разработке схем очистки

В тексте в основном шла речь о компоновке схем очистки рестриктаз, т. е. о том какие стадии и сорбенты и в какой последовательности применяются в конкретных случаях. Актуаль-

11-5933 6

161

ным является вопрос о путях подбора схем очистки (особенно в части, касающейся хроматографических стадий), которые в общем случае должны быть идентифицированы для каждого-фермента. Несмотря на довольно большой объем публикаций посвященных вопросам выделения и очистки рестриктаз, часть из которой была рассмотрена в настоящем разделе, данные о-том как были подобраны схемы очистки в них практически отсутствуют. Поэтому приходится предполагать, что разработчики следуют общепринятой практике препаративной биохимии белков — т. е. путем эмпирического подбора находят сорбенты,, последовательность их использования и условия проведения процесса. Для этого необходимо в режиме колоночной хроматографии апробировать пригодность выбранных сорбентов в различных условиях сорбции и элюции. Эти процедуры продолжительны, а разработанные схемы очистки часто включают этапы в той последовательности в какой они были испытаны, без рассмотрения других возможных вариантов ее решения.

Другой подход, заключающийся в изучении взаимодействия ферментов с сорбентами в статических условиях (в пробирке), иногда используемый при отработке схем очистки ферментов, не должен обладать перечисленными недостатками. В литературе имеется публикация, посвященная апробации этого подхода в случае разработки схем очистки рестриктаз [29]. Полученные результаты свидетельствуют, что предварительные исследования в статических условиях занимают по сравнению с колоночной хроматографией значительно меньше времени. Кроме того применение статического метода позволяет установить диапазон и характер влияния различных факторов (например, ионной силы) на связывание, что дает возможность, предсказать условия проведения колоночной хроматографии. В результате за краткое время удается апробировать ряд сорбентов, выбрать среди них наилучшие в отношении очистки и выхода целевого фермента и прогнозировать условия элюции в режиме колоночной хроматографии. Принципиальным различием между схемами разработанными путем их конструирования на основе предварительных опытов проведенных в колоночном режиме и в статических условиях является то, что в последнем случае, благодаря нетрудоемкости предварительных опытов, реальным является разработка именно оптимальных схем очистки — оптимальных в отношении спектра выбранных сорбентов, их числа и последовательности применения.

3.5. Выделение гомогенных препаратов рестриктаз

Гомогенные препараты рестриктаз в первую очередь необходимы для исследований, посвященных изучению их энзимати-ческих и физико-химических свойств, а также структурных особенностей. Исключительно перспективным является использо-

162

вание специфических эндонуклеаз — относительно просто организованных белков, отличающихся высокой избирательностью взаимодействия с субстратом, для изучения одной из кардинальных проблем современной молекулярной биологии — механизмов белок-нуклеинового узнавания. Несмотря на очевидную актуальность вышеуказанных исследований, выделению гомогенных препаратов рестриктаз долгое время уделялось значительно меньше внивания, чем вопросам получения функционально очищенных препаратов. Это наглядно иллюстрируется следующим соотношением: из более чем 1000 охарактеризованных рестриктаз, в литературе удалось обнаружить сведения только о 22 ферментах, выделенных в гомогенном состоянии.

С технологической точки зрения процедура выделения гомогенных препаратов в общем случае является более сложной задачей, чем задача получения функционально очищенных ферментов. Для достижения поставленной цели вынужденным является расширение арсенала методических приемов, используемых как в процес

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)