Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

omogenes Unidentified bacteria 36, 190] [36, 190] [165] [36, 190] [200]

? — данные отсутствуют; a) — коллекционный номер продуцента имеется в [190]; Ь)—точное название штамма-реципиента в литературном источнике не указано.

были клонированы в течение нескольких последних лет. Этому способствовала разработка специальных подходов для осуществления экспериментов, а также накопление данных о специфических требованиях к реципиентам рекомбинантных ДНК молекул, несущих гены рестрикции-модификации. В настоящее время является очевидным, что клонирование этих генов в общем случае не является тривиальной задачей, что довольно часто выражается в отрицательных результатах опытов. Поэтому ниже будут рассмотрены не только используемые с этой целью методические приемы, но и возможные потенциальные барьеры ее достижения. Ряд аспектов последней проблемы был рассмотрен в первой части книги (см. 9).

5.1. Методические аспекты клонирования генов rm

Клонирование генов, расположенных в плазмидах по очевидным причинам не представляет сколь-нибудь значительных методических трудностей. В свете сказанного понятен тот факт, что на первых порах клонированию подвергались в основном гены с плазмидной локализацией. Сложнее обстоит дело в случае хромосомных генов. Для конструирования банка рекомбинантных плазмид применяется типичный арсенал известных методов генной инженерии, который в случае клонирования генов rm не имеет какой-то специфики. Специфика заключается в методах отбора искомых клонов, выборе реципиентных штаммов и векторов для клонирования.

Для отбора клонов с фенотипом r+m+ применяется несколько подходов (см. табл. 23). Самым распространенным в по-

185

следнее время стал метод биохимической селекции рекомби-нантных плазмид, несущих экспрессирующийся ген метилазы, впервые предложенный Манном и др. [174], но реализованный другими исследователями [160, 200, 268, 279]. С этой целью из клонотеки выделяют суммарную плазмидную ДНК и обрабатывают ее рестриктазои из той же системы RM, которая подвергается клонированию. Очевидно, что устойчивыми к расщеплению окажутся только те плазмиды, которые содержат экспрессирующийся ген метилазы. Обработанной таким образом ДНК ретрансформируют реципиентный штамм. После проведения одного или нескольких таких циклов в полученных клонах проверяют эндонуклеазную активность in vitro [37, 77, 160, 250, 268, 279] или наличие рестриктазы по способности клеток ограничивать фаги [22, 139, 200]. Обсужденный метод позволяет обогащать клонотеку рекомбинантными плазмидами, содержащими ген метилазы. В отношении рестриктазы никакого отбора не проводится. Тем не менее, учитывая возможность тесного сцепления обоих генов, довольно часто удается в отобранном клоне наряду с метилазой обнаружить и рестрик-тазу [77, 279].

Применение биохимической селекции оправдано только в случае наличия на векторе сайтов узнаваемых клонируемыми ферментами. В противном случае возникает вопрос либо поиска таких векторов, либо их конструирования.

Наряду или вместо биохимической применяется и биологическая селекция, основанная на ограничении различных фагов клонами, несущими рестриктазу. Согласно литературным данным, клоны Е. coli с RM системами, за несколькими исключениями, ограничивают фаг Xvir в 101—107 раз [35, 54, 103, 148]. К исключениям следует отнести те случаи, когда несмотря на наличие в клетках рестриктазы (проявляющей активность in vitro), ограничение фагов вообще не наблюдается. Это отмечено во всех случаях, когда клетки содержащие только рестриктазу не гибнут. Обсуждаемое явление, впервые отмеченное в случае RPaeR7 [103], оказалось не ограничивается только этим примером. Таким же свойством обладают еще ряд рестриктаз: EcoRI [108], Haell, HgiAI, Hinfl, Pst I и Xba I [250]. Клоны, содержащие указанные рестриктазы, отличаются в разной степени сниженной жизнеспособностью. Высказываются мнения, что наблюдаемое явление объясняется наличием: а) в Е. coli высокоэффективной системы репараций повреждений, вызываемых специфическими эндонуклеазами [35, 250]; б) каких-то механизмов, ограничивающих действие некоторых рестриктаз in vivo на немодифицированную ДНК [ЮЗ]; в) необходимостью наличия обоих партнеров системы RM для эффективной рестрикции фагов [103].

В случае генов rm Taq I, клонированных в Е. coli, рестрикции фагов не наблюдалось и в присутствии в клетках ак-

186

тивной метилазы (и рестриктазы) [250]. Возможно, это связано с тем, что эта эндонуклеаза синтезируемая термофильным микроорганизмом функционирует при 65° С. Е. coli, как известно, выращивается при значительно более низкой температуре.

Вопрос о том, насколько широко распространено рассматриваемое явление (тем более учитывая многочисленные факты о нежизнеспособности r+m_ клеток), остается открытым. Вместе с тем очевидно, что неспособность некоторых г+ клонов рест-риктировать фаги, снижает потенциальные возможности биологического метода для отбора клеток, несущих клонированные гены rm. Применим ли обсуждаемый метод отбора к RM системам, отличающимся низкой эффективностью рестрикции — вопрос остается открытым. Резюмируя следует предположить, что биологический метод отбора может оказаться не всегда адекватным для решения поставленной задачи.

Оба обсуждаемых метода часто используются комбинировано, т. е. для обогащения клонотеки генами метилазы используют биохимический метод селекции, а на следующем этапе отбирают клоны, устойчивые к фагу [22, 139, 200].

Иногда для достижения поставленной цели применяется метод поэтапного клонирования. На первом этапе клонируется ген метилазы. Для определения предположительной локализации рестриктазного гена проводится физическое картирование последовательностей донорной ДНК, окружающих ген метилазы. В качестве зонда для блот-гибридизации используется ген метилазы [147, 148] или синтетические олигонуклеотнды [124]. Донорная ДНК перед лигированием обрабатывается отобранными таким образом рестриктазами с целью вырезания фрагмента предположительно содержащего не только ген метилазы, но и рестриктазы. Однако не всегда реализация такого подхода дает положительный результат. Поучителен в этом отношении пример по клонированию генов rm Dde I [124]. В этом случае на первом этапе удалось клонировать только ген метилазы. Впоследствии это нашло объяснение в том, что при получении банка генов провели исчерпывающий гидролиз донорной ДНК рестриктазой Hind III, которая как потом оказалось имеет сайт в гене рестриктазы. Для картирования генов rm Dde I методом блот-гиб-ридизации в качестве молекулярных зондов применили мети-лазный ген и смесь синтетических олигонуклеотидов, имеющих гомологию с геном рестриктазы. Структура олигонуклеотидов была предсказана на основе анализа аминокислотной последовательности N конца рестриктазы, выделенной в гомогенном состоянии из природного продуцента. В результате проведенных исследований было определено, что гены rm Dde I расположены на Pst I фрагменте хромосомной ДНК величиной 4,8 кб. Однако попытки клонировать этот фрагмент не дали

187

положительн

страница 66
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)