Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

чена клонотека, состоящая из 80 000 независимых гибридных клонов (против 2—12XJ03 в первых опытах), несущих рекомбинантные плазмиды, которые в сумме примерно в 50 раз перекрывали геном донорного штамма. Из такой большой выборки было выделено всего два клона, несущие функционирующие гены rm Ben I. Физическое картирование этих двух рекомбинантных плазмид позволило обнаружить интересный факт, заключающийся в том, что в обоих клонах точка вырезания из хромосомы В. centrosporus (продуцента rmBcn I) оказалась расположенной очень близко к гену метилазы (чего не наблюдалось со стороны гена рестриктазы, где имелись области хромосомной ДНК разной протяженности). Если это совпадение не является случайным, то можно предположить, что совместное клонирование генов рестриктазы и метилазы Ben I в Е. coli на фрагменте, содержащем прилегающие в хромосоме В. centrosporus к гену метилазы определенные ДНК-последовательности, по каким-то причинам является невозможным. Это может быть обусловлено, например, неста-

190

бильностью рекомбинантных плазмид или несогласованной экспрессией рестриктазы и метилазы, опосредованных обсуждаемыми, прилегающими к гену метилазы Ben I последовательностями ДНК, проявляющими эту свою «функцию» в новом для них окружении — в клетках Е. coli в составе рекомбинантной молекулы. В случае MDde I необходимый уровень экспрессии был достигнут тоже только в случае ее клонирования в определенным образом вырезанном фрагменте ДНК [124].

Таким образом, не исключено, что для клонирования генов рестрикции-модификации, по меньшей мере в некоторых случаях, необходимо их вырезание из исходной ДНК в соответствующем окружении. Необходимость выполнения этого требования несомненно должна значительно снизить вероятность успешного клонирования таких генов и связана с необходимостью получения больших клонотек, желательно на основе фрагментов клонируемой ДНК, полученных путем ее расщепления наиболее случайным образом.

5.2.2. Ограничение модифицированной ДНК

Довольно неожиданным было недавнее открытие еще одного барьера для клонирования генов rm, связанного с наличием у Е. coli штаммо-специфических метилцитозин и метил-аденин-специфических систем рестрикции. Имеется в виду системы, влияющие на перенос в клетки ДНК, содержащей 5-метилцитозин и 6-метиладенин в специфических последовательностях [117, 208]. Давно было известно, что Е. coli ограничивает ДНК, содержащую необычно модифицированный цитозин — 5-гидроксиметилцитозин. Этот феномен контролируется генами rglA и rglB [168, 215]. Оказалось, что рестрикция 5-метилцитозин, содержащей ДНК, обусловлена этими же генами, получившими в последнем случае название mcrA (rglA) и тсгВ. (rglB) [206, 208, 226].

Рестрикция проявляется при трансформации или трансфек-ции штаммов, содержащих mcrA или тсгВ гены дикого типа плазмидами или фагами, в составе ДНК которых имеется 5-метилцитозин в специфических последовательностях [208, 227]. Такой же эффект наблюдается и в отношении рекомбинантных ДНК молекул, имеющих в своем составе экспресси-рующиеся клонированные гены метилаз определенной специфичности [21, 2081.

Ген тсгВ локализован на 98,5 мин генетической карты Е. coli, рядом с генами hsdR, hsdM, hsdS, обеспечивающими рестрикцию-модификацию I типа у Е. coli К-12 [210]. В той же области картирован и ген mrr, кодирующий метиладенин специфическую рестрикцию [117]. Анализ последовательностей, узнаваемых метилазами, указывает на то, что необходимым компонентом сайта, узнаваемого системой рестрикции Mcr В, являются последовательности GmC или PumC [21, 208]. McrA

14*

I9L

Таблица 25

МсгА и МсгВ фенотипы некоторых штаммов Е. colia>

Фенотип Штамм Фенотип

Мег В

Mcr А Мег в Мег А + + Hfr4000 + +

+ + Hfr Cavalli +

+ н HErH thi — +

— + HfrP4X6 + +

JH132 ¦— Н

— — JK268 —

JM83 н + н

— — JJVU01 + — + JM107 — +

— + JM107MA2 — —

—¦ + 5K — +

+ н K12 + +

— н, K802 —

—¦ н K803 —

— + КЮ + н

— — KMBL1164 —' — + LE392 — +

н + MCI 061 — —

— — MM294 + +

+ + NM477 ¦— —

—¦ н NM494 — —

+ + NM514 — +

— + NM538 —~ +

— + NM554 -—¦ —

— + NM621 — —

— — PA309 + +

— — PCO950 н +

+ + Q358 — +

+ + RL88 — —

+ — RR1 + —

+ — SK5022 + +

н + W6 +

— — W3110 + +

— — W4597 + +

— — WW3352 — +

— + X149 — +

— + Y10 + +

_ — Y53 + _1_

— + Y70 — +

н + Y1084 — +

н + Y1088 — +

— — Другие (не К-12)

— н штаммы Е coli

— н Е. coli В + +

+ — Е. coli В/г н +

+ Е coli С н

Н — нетестировано а)—таблица подготовлена на основе данных, приведенных в публикации [207]. б) — подчеркнуты штаммы, часто используемые в качестве реципиента в экспериментах по генной инженерии.

192

ограничивает ДНК, модифицированную метилазой Нра II, узнающей последовательность 5'CCGG и модифицирующей внутренний цитозин [208]. Установлено, что необходимым компонентом сайта, узнаваемого системой рестрикции mrr является последовательность GmAC или CmAG(117]. Рассмотренные системы рестрикции следует принимать во внимание в экспериментах по клонированию генов рестрикции-модификации. В таблице 25 указаны Mcr А и Mcr В фенотипы штаммов Е. coli. Штаммы Е. coli менее исследованы в отношении Mrr фенотипа. Однозначно его наличие определено в случае штамма НВ101 [117].

Не исключено, что описанные системы ограничения метилированной ДНК не исчерпывают возможных вариантов специфичности [207, 208]. Поэтому обсуждаемый фактор всегда следует иметь в виду при поиске причин неудачного клонирования метилаз со специфичностью, отличающейся от исследованных в отношении ограничения вариантов.

5.3. Конструирование продуцентов рестриктаз и метилаз

Клонирование генов рестрикции-модификации применяется и для получения повышения продукции этих ферментов клетками. Учитывая тот факт, что клонирование проводится в мно-гокопийные векторные плазмиды, следовало бы ожидать достижения поставленной цели за счет эффекта дозы гена. В ряде случаев это действительно наблюдалось, например, содержание рестриктаз Xba I и FnuD I в результате клонирования соответствующих генов в Е. coli в составе плазмиды равнялась ЗХЮ5 и 106 ед./г биомассы соответственно [279], что значительно превысило аналогичные показатели, характерные для исходных продуцентов X. badri и F. nucleatum. Отмечено увеличение продукции и ряда метилаз: BspR I в 3 раза [270J, Msp I в 3—4 раза [285], Dpn II в 5 раз [82]. В случае клонирования в Е. coli генов rm Pst I выход рестриктазы был близок к ее уровню в исходном штамме P. stuartii [284]. Однако, перенос рекомбинантной плазмиды, содержащей эти гены, в гомологичный хозяин (P. stuartii 164) дал 10-кратное увеличение синтеза рестриктазы Pst I, по

страница 68
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)