Биологический каталог




Принципы структурной организации нуклеиновых кислот

Автор В.Зенгер

кий интерес; мы рассмотрим их более детально в гл. 8.

Неравномерное распределение плотности заряда приводит к появлению дипольного момента. Приведенное на рис. 5.1 распределение плотности заряда может быть представлено для каждого из оснований единственным вектором, направление и величина которого задают ди-польный момент ц. Вектор дипольного момента обычно лежит в плоскости основания. Его ориентацию определяют относительно некоего выбранного направления в молекуле (табл. 5.1). Соответствующие теоретические расчеты поддаются экспериментальной проверке лишь в отношении величины дипольного момента, которую можно непосредственно измерить. Ориентация определяется только в том случае, если в распоряжении исследователя имеются данные о величинах дипольных моментов нескольких различным образом замещенных производных исследуемой молекулы.

5.2. рК ОСНОВАНИЙ, САХАРОВ И ФОСФАТНЫХ ГРУПП. МЕСТА НУКЛЕОФИЛЬНОЙ АТАКИ

Протонирование и депротонирование оснований происходит при отклонении рН в обе стороны от нейтрального значения рН на 3,5 единицы, т. е. в интервале рН 3,5 ~ 10,5 (табл. 5.2). Из данных табл. 5.2 следует, что атомы водорода амидоподобных группировок (при атомах N3 и N, в урациле и гуанине соответственно) проявляют выраженные кислотные свойства, а эндоциклические атомы азота-основные, чего и следовало ожидать, исходя из распределения плотности заряда. Расстояния между основаниями и отрицательно заряженными фосфатными группами в 3'-и 5'-нуклеотидах неодинаковы, поэтому различается и электростатическое притяжение между ними. В результате соответствующие значения

Физические свойства нуклеотидов

125

рК оснований при переходе от нуклеозидов к 3'- и 5'-нуклеотидам увеличиваются примерно на 0,5 [404].

При щелочных рН протоны, связанные с атомами N3 урацила и тимина и с атомом Nj гуанина, отщепляются. При слабокислых рН (> 3) протонируются атомы Nt аденина и N3 цитозина, а при более кислых (<2)-также атом N7 и гуанина и аденина (рис. 5.2) и атом 04 урацила [401-403, 405-412]. Кристаллографические исследования показали, что при достаточно низких значениях рН (< 2) ^-замещенный гуанин протонируется по азоту N7 [413, 414], аденин подвергается двойному протонированию по атомам N, hN7 [415], а 1-метилурацил протонируется по атому 04 [416]; при этом геометрия связей меняется так же, как и в обычных резонансных структурах: если протонируется эндо-циклический азот, то соответствующий валентный угол С—N—С увеличивается примерно на 5° [191] (разд. 4.5).

Во всех описанных выше случаях протонируются эндоциклические атомы азота, а не экзоциклические [417]. Это положение согласуется с распределениями зарядов, представленными на рис. 5.1. Более того, оно получило квантово-химическое объяснение. Обычно распределение заряда рассчитывается для изолированной молекулы, находящейся в основном состоянии [418]; в то же время такие химические реакции, как протонирование, зависят от распределения заряда в переходном состоянии, которое сильно отличается от основного. Карты изолиний электростатического потенциала, рассчитанные для четырех оснований при сближении их с протоном или с нуклеофильным алкилирующим агентом, наглядно показывают, что атаке подвергаются в первую очередь эндоциклические атомы азота и атомы кислорода кетогрупп, а не аминогруппы [418].

При сильнощелочных условиях депротонируются вторичные гидроксильные группы рибозы. То обстоятельство, что соответствующие значе-

Таблица 5.2 Значения рКа оснований в составе нуклеозидов и нуклеотидов, экстраполированные к нулевой ионной силе1'

Соединение/место

протонирования и Нуклеозид 3-фосфат 5-фосфат

депротонирования

Аденозин/N! 3,52 3,70 3,88

Цитидин/Из 4,17 4,43 4,54

Гуанозин/Nj 9,42 9,84 10,00

Уридин/ТЧз 9,38 9,96 10,06

2'-дезокситимидин/ 9,93 10,47 N3

Приведенные значения получены при концентрации соединений 5 -10 5 М и температуре 20°С. Поскольку 5'-фосфат расположен ближе к основанию, чем 3'-фосфат, его влияние на рК, оказывается сильнее. (По [401]. Более полную таблицу см. в работах [402, 403].)

126

Глава 5

Таблица 5.3. Значения рКа для вторичной ионизации фосфатных групп в составе нуклеозидмоно-, ди-и трифосфатов1' [424]

Фосфат

Соединение _

моно- ди- три-

Аденозин 6,67 7,20 7,68

Цитидин 6,62 7,18 7,65

Гуанозин 6,66 7,19 7,65

Уридин 6,63 7,16 7,58

Первичная ионизация происходит при рН 1-2 (рис. 5.2).

ния рКа ~ 12,4 ниже, чем рКа первичной или изолированной вторичной гидроксильных групп, обусловлено тем, что отрицательно заряженные группы С—О" стабилизируются наличием вицинальных гидроксилов рибозы, между которыми возникают индуктивные эффекты и образуется водородная связь [420, 421] (рис. 5.2) (аналогичные свойства гидроксилов глюкозы рассмотрены в работах [422, 423].

Фосфатные группы в составе нуклеозидмоно-, ди- и трифосфатов имеют два значения рК [424, 425]. При низких рН, в районе 1-2, в результате протонирования отрицательный заряд фосфатной группы нейтрализуется полностью, а заряд ди- и трифосфатов-частично. В результате среднее значение отношения заряд/фосфат для дифосфатов равно 1/2, а для трифосфатов-1/3 или 2/3. На стадии первичной ионизации от каждого фосфата отщепляется по одному протону и каждая фосфатная группа приобретает по одному отрицательному заряду (отношение заряд/фосфат = 1,0). Вблизи рН 7 начинается вторая стадия ионизации, при которой от концевого фосфата отщепляется последний протон (табл. 5.3). В диэфирах, подобных ДНК и РНК, или в коферментах NAD + и CDP-холин при физиологических условиях такого протонирования не происходит, поэтому интерес представляет только первая стадия ионизации.

Таблица 5.4. Некоторые замещенные производные урацила и соответствующие значения рК

Названия соединения Структурная формула рК

5,6-дигидроурацил

> 11

Физические свойства нуклеотидов

127

1 -метил-5-бромурацил

о

СН,

hn

5-метилуридин O^^n^ 9,7

I

к

о

Уридин "У |l 9'3

I

R

о

in'

2-тиоуридин ^ 8.8

а N

R

S

hn

4-тиоуридан Jv. >1 8,2

о n I

R

о

hn у

R

s

hn'

2,4-дитиоуридин II 7,4

s n I

R

о

1-метил-6-азаурацил HN || 6,9

I

R

R-рибоза или метильная группа.

Глава 5

NH2

Рис. 5.2. Места протежирования в аденозинди-фосфате (ADP). Аминогруппа аденина не протонируется даже при низких рН. Первичная ионизация фосфатных групп завершается в области рН 2, выше рН 3,8 аденин становится нейтральным. При рН 6,8 происходит вторичная ионизация фосфатных групп, и при рН > 12,5 депротони-руются вторичные гид-роксилы рибозы.

Физические свойства нуклеотидов

129

Химическая модификация оснований непосредственно влияет на величину рКа (см. табл. 5.4 [402, 410, 426]). Так, рКа 5-метилуридина, равное 9,7, превышает рКа уридина, которое равно 9,3. При замене кетогруппы на тиокетогруппу в 2,4-дитиоуридине рКа уменьшается до 7,4. Уменьшение рКа до 7,8 наблюдается для 5-бромзамещенного производного уридина. Поскольку значения рКа некоторых модифицированных нуклеозидов близки к физиологическим значениям рН, такие нуклеозиды встречаются и в виде ионов, и в виде различных таутомерных форм (см. следующий раздел).

5.3. ТАУТОМЕРИЯ ОСНОВАНИЙ

Если в гетероциклических молекулах протоны, связанные с атомами азота, способны переходить на другие свободные атомы азота либо на атомы кислорода кетогруппы, то в растворе зти молекулы будут присутствовать в разных таутомерных формах, быстро переходящих одна в другую [198, 427]. Такой тип таутомерии с прототропными переходами, сильно зависящий от диэлектрической постоянной раствора и рК соответствующего гетероатома, был предметом многочисленных исследований [428, 429].

Гетероциклы нуклеозидов также подвержены таутомерным превращениям. В незамещенных основаниях может происходить прототропная миграция от одного эндоциклического азота к другому, типа N7—Н <=± N9—Н в пуринах и N,—Н г* N3—Н в пиримидинах (рис. 5.3). Однако такой тип изомеризации, требующий наличия незамещенного атома N9 в пуринах и N, в пиримидинах, мы в дальнейшем рассматривать не будем, поскольку в нуклеозидах это условие не выполняется. В этом последнем случае мы имеем дело с переходами ке-то енол и амино имино (рис. 5.4). Поразительно, насколько изменение в положении атома водорода меняет характер образуемых основанием водородных связей: кетогруппа с акцепторными свойствами в енольной форме становится донором, а отдающая водород аминогруппа при переходе в форму замещенного имина-акцептором. Если, однако, в последнем случае связь N—Н способна менять ориентацию, то иминогруппа может выступать и в роли донора.

В результате таутомерных превращений урацил и гуанин в енольной форме при спаривании могут имитировать цитозин и аденин, а цитозин и аденин в иминоформе-урацил и гуанин (рис. 5.4). В самореплицирующейся системе по Уотсону и Крику, основанной на принципе специфического спаривания, подобные метаморфозы могут привести к катастрофическим последствиям. Именно поэтому таутомерия оснований была детально изучена методами УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии, кристаллографическими методами (все эти результаты суммированы в работе [429]; более поздние данные описаны в работах [430-433]), а также методами квантовой химии [179, 180].

9-509

130

Глава 5

Рис. 5.3. Прототропная таутомериза-ция незамещенных аденина, гуанина и цитозина

Наиболее существенные результаты этих исследований таковы. Ке-то- и амино-формы, представленные на рис. 2.1 и 2.2, являются основными в случае природных оснований. Доля имино- и енольных тау-томеров для аденозина [434] и 1-метилурацила [410] составляет менее 0,01%. Такая картина наблюдается во многих растворителях с различными диэлектрическими постоянными и даже в газах [435]. Ранние исследования производных цитозина и гуанина методом ЯМР, согласно которым доля редких имино- и енольных форм составляет 15%, оказались ошибочными [436, 437]. Квантово-химические расчеты слишком чувствительны к длине связей О—Н, и их нельзя использовать для установления деталей таутомерных состояний [438]. К интерпретации кристаллографических данных с позиции таутомерии следует тоже подходить с осторожностью, поскольку различия в длине С—О-связей (в урациле) можно считать значимыми только в том случае, если они превышают За [439]. Кроме того, координационное связывание 02 кето-группы с катионами, например с К+, может влиять на длину связи С—О и искусственно индуцировать енолизацию [440].

Можно смело утверждать, что в природных основаниях преобладают кето- и амино-таутомерные формы природных оснований; это соответствует назначению оснований узнавать нужного партнера для спаривания-необходимое условие, налагаемое на самовоспроизводящийся генетический аппарат. Несколько замечаний относительно частоты мутаций, вызванных неправильным спариванием оснований вследствие их таутомеризации, можно найти в гл. 6.

Рис. 5.4. Кето-енольная и амино-иминная таутомеризация оснований в составе нуклеозидов. Стрелки с символами А и D указывают на акцепторные и до-норные группы, способные к образованию водородных связей. Обратите внимание, что в енольной форме G становится подобным A, a U-C; в иминоформе А эквивалентно U или G, a C-U. Если имино группа (=N—Н) и енольная (О—Н) группа могут менять ориентацию, то появляются дополнительные возможности для образования водородных связей. К счастью, доля оснований в ке-то- и аминоформах при физиологических условиях > 99,99% (см. текст).

9*

132

Глава 5

Рис. 5.5. Зависимость константы fcj кето-енольного равновесия для Н6,Н6,Н9-триметилизогуанина от природы растворителя [447]. Полярность растворителя ?Тзо определена в соответствии с работой [447], Кх выражена в логарифмических единицах. Ке-то-енольное равновесие для изогуани-на сильно зависит от растворителя, поэтому данное основание не находит применения в химии нуклеиновых кислот.

В случае модифицированных оснований картина несколько меняется, и становится ясным, почему природа в качестве основного объекта выбрала четыре нормальных основания. Природный изогуанозин, структурный аналог гуанозина (рис. 5.5) [441, 442], не включается в ДНК или РНК, хотя с чисто функциональной и структурной точек зрения он мог бы спариваться с синтетическим изоцитидином и заменять обычный аналог. Причина такой дискриминации заключается в необычной кето-енольной таутомеризации изогуанозина, равно как и соответствующего замещенного изогуанина, которая сильно зависит от полярности растворителя и температуры [443].

Другие химические модификации, такие, как замена кетогруппы в шестом положении пуриновых нуклеозидов на тиокетогруппу, увеличивают долю енольных таутомеров до 7% [444]. В противоположность этому для 4-тиоурацила, замещенного по положению 1, может существовать только кето-таутомерная форма [445]. В ряду галогензаме-щенных по положению 5 производных уридина введение фтора практически не уменьшает долю преобладающей кетоформы, хотя значение рКа = 7,4 близко к физиологическим значениям рН [446]. Подобным же образом можно было бы ожидать, что введение брома, оказывающее сходное влияние на рКа (7,8), не будет затрагивать кето-енольной таутомеризации, однако на самом деле доля енольных таутомеров возросла при этом в 10 раз, составляя тем не менее лишь 0,1-1% от доли кетоизо-меров [410]. Вместе с тем для увеличения доли имино- и енольных тау-томерных форм совсем не обязательна модификация оснований. В разд. 6.1 приводятся данные ЯМР, показывающие, что в тРНК из всех оснований, принимающих участие в спаривании, от 5 до 15% находятся в редких таутомерных формах, в которых атомы водорода,

Физические свойства нуклеотидов

133

принимающие участие в образовании водородной связи, способны согласованно переходить от донора одного основания к акцептору комплементарного основания.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Особенности взаимодействия нуклеотидов с другими молекулами, как правило, можно объяснить характером распределения в них плотности заряда. Так, аминогруппы оснований, являющиеся хорошими донорами при образовании водородной связи, несут частичный положительный заряд, тогда как атомы кислорода кетогруппы и атомы азота оснований являются хорошими акцепторами, а атомы кислорода сахарного кольца-плохими. Аналогично акцепторные свойства атомов кислорода, принимающих участие в образовании эфирной связи в фосфатных группах, менее выражены и подавляются свободными атомами кислорода, несущими частичный отрицательный заряд. Значения рК оснований и фосфатных групп лишь в некоторых случаях отражают распределение плотности заряда, поскольку на величину рК влияет их основность, а не электроотрицательность. Так, при низких рН протонируются эндоци-клические атомы азота, а не аминогруппы, а моноэфиры фосфатных групп имеют два основных значения рК-одно в области 1-2, а другое вблизи 7.

В растворе основания в принципе могут находиться в двух таутомерных формах. Однако обычные кето- и аминоформы всегда превалируют над енольной и имино-формами, доля которых, как правило, не превышает 0,1%. Эта величина, однако, может сильно меняться для модифицированных оснований или для оснований в составе пары.

ГЛАВА 6

Силы, ста

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79

Скачать книгу "Принципы структурной организации нуклеиновых кислот" (9.68Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.09.2019)