тому более напряженную) конформацию, чем в нециклических ну-клеотидах. С другой стороны, шестичленный циклический триметилен-фосфат с относительно низкой энтальпией гидролиза, 3,8 ккал-моль -присоединяясь к рибозе с образованием циклического 3',5'-нуклеотида, сохраняет свою геометрию. Однако при этом изменяется конформация рибозы: угол С2.—С3.—С4.—04. становится равным ~ 50°, т.е. на 15° превышает значение соответствующего угла в нормальной рибозе. Это снова приводит к напряжению системы, энтальпия которой увеличивается на 7,9 ккал • моль _ !.

Итак, оценка энергии связывания циклических фосфодиэфиров с рибозой показывает, что увеличение энтальпии гидролиза пятичленных 2',3'-нуклеотидов обусловлено напряжением в двух слившихся друг

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды

193

с другом пятичленных системах. В циклических 3',5'-нуклеотидах в основном напряжена только рибоза; конфигурация фосфатной группы в составе шестичленного кольца почти не изменяется [644-646].

7.3. НУКЛЕОЗИДЫ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ САХАРОМ: ГАЛОГЕНЗАМЕЩЕННЫЕ, АРАБИНО- И ос-НУКЛЕОЗИДЫ

Из множества синтетических нуклеозидов с модифицированным сахаром особый интерес представляют те, в которых вторичные гидроксилы 02.Н и Оэ.Н замещены галогеном, амино- или азидной группами. Как отмечалось в разд. 4.3, электроотрицательность этих заместителей непосредственно влияет на конформацию сахара. Более того, если в состав полимерной РНК входят 2'-дезокси-2'-галогензамещенные нуклеозиды, то стабильность молекулы in vivo существенно изменяется: РНК, модифицированную таким образом, РНКаза не в состоянии гидролизо-вать по механизму, описанному в дополнении 7.1.

В этом разделе галогензамещенные нуклеозиды, не отличающиеся по структуре от нормальных нуклеозидов, мы рассматривать не будем, а обратимся к арабино- и а-нуклеозидам; первые интересны с биологической точки зрения, а вторые-со структурной.

Арабинонуклеозиды привлекли к себе особое внимание в связи с тем, что они обладают широким спектром действия в отношении ДНК-содер-жащих вирусов и РНК-содержащих онкогенных вирусов (онкорнавирусы), как in vivo, так и in vitro. Их можно получать из природных источников; особенно широкое применение в химиотерапии нашел 9-Р-О-арабинофу-ранозиладенин (арабинозид аденина, видарабин, ага-А) [647, 648]. Арабинонуклеозиды отличаются от своих рибоаналогов прежде всего конфигурацией при атоме С2.: 02.-гидроксил находится в имс-ориентации относительно связи Сг—N (рис. 7.4). Это приводит к незначительным изменениям длин связей и валентных углов фуранозного кольца [167], что, однако, не влияет ни на конформацию сахара (она по-прежнему остается С2.-эндо или Су-эндо), ни на ориентацию относительно экзоци-клической С4.—С5.- и гликозидной Сг—N-связей (они, как и обычно, соответствуют областям ск и анти). Высокая-анти (— ск)-конформация в арабинонуклеозидах запрещена, и эта особенность позволяет объяснить некоторые их свойства [649].

В кристаллических структурах ряда арабинофуранозильных нуклеозидов обнаружена внутримолекулярная водородная связь, соединяющая атомы 02. и 05. (рис. 7.4). Однако, согласно спектроскопическим данным, полученным для раствора, в нейтральной среде эти связи почти не обнаруживаются [650]. Вместе с тем в щелочной среде, когда ги-дроксильная группа 02.Н депротонируется, или в условиях in vacuo, принимаемых в теоретических расчетах [652, 653], образование внутримолекулярных водородных связей 02.Н ¦ ¦ ¦ Os. становится существенным [651]. Гидроксильная группа 02.Н находится в имс-ориентации относительно гликозидной связи Су—N, и это должно препятствовать враще-

13-509

194

Глава 7

Дополнение 7.1.

О механизме действия панкреатической рибонуклеазы (РНКазы А)

РНКаза А расщепляет одноцепочечные РНК с З'-конца пиримидиновых нуклеотидов. Сначала образуется промежуточный фрагмент с концевым 2',3'-0-ци-клофосфатом (схема 1), который затем гидролизуется с образованием З'-фосфа-та. В этом каталитическом процессе участвуют два гистидиновых остатка (His 12 и His 119), расположенные в активном центре фермента:

о^он

Пиримидин | Пиримидин j Пиримидин

j'^T Гидролиз лкация I I» -I I..

Трансэтерификация ^ ^» -=- ^ ^

0=F^0 Основание //\ 0=P-0 ©

0 OH

H20

0=P—О© Основание

°-v°nJ

0 OH

0=P-0 © I

0

Схема 1

Возникает следующий вопрос: по какому механизму идет реакция-по линейному (Sjv|2) или по смежному, при котором в реакции принимает участие атом 02 пиримидина? В обоих случаях образуется промежуточное пентакова-лентное соединение фосфора, которое в смежном механизме подвергается псевдовращению, чтобы перевести уходящую группу (02.) в апикальное положение [722].

о он

еО»Р—О—ме

Схема 2

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды

195

Поскольку (циклическая) фосфодиэфирная группа не является хиральной, анализ продуктов обычного гидролиза не дает никакой информации о механизме реакции. Если, однако, в фосфатную группу включить атом серы, после чего эта группа станет хиральной, а гидролиз проводить в присутствии метанола, то один из продуктов реакции также будет хиральным.

Как видно из схемы 3, стереохимия этого продукта свидетельствует о том, что катализируемая РНКазой реакция идет по линейному механизму, поскольку в случае смежного механизма должен был бы образовываться его диастереизо-мер [699]. По такому же принципу был установлен механизм многих других ферментативных реакций, идущих с участием нуклеозидмоно-, ди- и трифосфа-

тов [698].

U

Смежный

и

и

R0

U

и

о он

OR

Схема 3

13'

196 Глава 7

Рис. 7.4. Два арабинонуклеозида. А. l-P-D-арабинозилцитозин, в котором имеется водородная связь 02.Н---05. [714]. Б. 9-Р-В-арабинозиладенин (видара-бин, ага-А)-противовирусный препарат с широким спектром действия [715]. Внутримолекулярные водородные связи между атомами 02. и 05. образуются только в условиях, когда гидроксильная группа рибозы депротонирована (рН >

> 12,5). При физиологических условиях число таких связей невелико [651].

нию основания. Действительно, из девяти изученных на сегодняшний день кристаллографическими методами арабинофуранозильных нуклеозидов ни один не был обнаружен в сын-конформации. Однако в растворе взаимопревращение син <=> анти все же имеет место (правда, с меньшей скоростью из-за более высокого энергетического барьера, препятствующего вращению).

а-Нуклеозиды представляют собой конформационные энантиомеры обычных рибоиуклеозидов. Если в арабинофуранозильных нуклеозидах центром конформационной инверсии был атом Сг, то в а-нуклеозидах таким центром служит аномерный углерод Су (рис. 7.5). В природных полимерных нуклеиновых кислотах а-нуклеозиды не обнаружены, одна-

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды

197

"ко в живых организмах они присутствуют либо в виде мононуклеози-дов, либо в составе малых молекул [654-656]. Особенно важен а-ну-клеозидный компонент витамина В-12 [657, 658]. а-Нуклеозиды могут .служить субстратом 5'-нуклеотидаз [659, 660]; кроме того, они обладают значительной антиметаболитной активностью в различных системах [661, 662].

Гетероцикл присоединяется к атому Сг, находящемуся в а-конфигу-грации, и занимает t/нс-положение относительно связи С2.—02.. Это Доказывает определенное влияние на конформацию сахарного кольца. Конформации сахарных остатков в составе а-нуклеозидов можно рассматривать как энантиомерные формы Сахаров в Р-нуклеозидах; в таком случае наиболее предпочтительными окажутся конформации |С2,-экзо и С3.-экзо (или С^-эндо) [663]. Такое обращение конформации указывает на то, что тип гликозидной связи (а или Р) непосредственно влияет на конформацию сахарного кольца.

Как и в Р-нуклеозидах, преимущественной ориентацией относительно гликозидной связи в случае а-нуклеозидов является анти. Однако, судя по кристаллографическим данным [664] и по данным ЯМР в растворе [638, 665, 666], преобладание ск-ориентации относительно связи

ftic. 7.5. Молекулярная структура двух а-нуклеозидов. А. l-a-D-рибофуранозил-Цитозин [716]. Б. а-0-2'-амино-2'-дезоксигуанозинмоногидрат [717а] В обоих нуклеозидах основание находится в антм-ориентации. В производном цитозина сахар находится в С3.-эндо(эЕ)-конформации, а в производном аденина-в С2.-эндо(2Е).

о I

hn' 4nh

Рибоза 1 Псевдоуридин (^)

hn

• H ¦H H

-n"

Рибоза 2 Дигидроуридин Шили hu)

о

hn-vch3

oV

I

Рибоза

3 Ри боги ми дин (Т)

о

HN^V-ОсНз

Рибоза 4 5-Метоксиуридин (mo^U)

ик|Д^осн2со2н

Рибоза

5 Уридин-5-оксиуксусная кислота (V)

имА^сн2со2сн3

hnA^ch2co2ch3

o^V

6 5-Метоксикарбонил-метилуридин (псп^и)

hn s

О

Д^СН^НСНз

У

I

hn^ o^-n

Рибоза 7 4-Тиоуридин is4U)

со2н

I О

НС——СН2

nh,

0*^-n

Рибоза

9 5-(Метоксикарбонилметил)-2-тиоуридин 1° 5-Метиламинометил-2-тиоуридин 11 3- (3-амино-3-карбоксипропил)

уридин (acp3U)

(mcn5s2UI nh,

n<

,СН3 I

Рибоза 13 5-Метилцитидин {m5C)

(mnm5s^U)

NHCOCH3

/)

o^NX I

Рибоза

nh2

Рибоза 15 2-Тиоцитидин is2C)

О

sXj I

Рибоза

8 5-Метил 2-тиоуридин (m5s2UI

nh

H,C,

I j

I

Рибоза 12 З-Метилцитидин (т3С)

Рибоза 16 1-Метилиноэин (m1! )

Рис. 7.6. Структурные формулы минорных нуклеозидов и оснований, обнаруженных в тРНК [667]. У оснований «Y», «Yt» и «пе-роксиУ» остаток рибозы присоединяется в основном по положению N9.

HN

Рибоза 17 Инозин (I)

,сн3—сн=с

.СН3

сн3

H3CS'

Рибоза

21 2- Метилтио-N -изопентенил-аденозин s2 6А О

н3с,

Рибоза

25 1-Метилгуанозин (m'G)

к. .сн3

Рибоза

18 ^-метиладеноэин (m6A>

СН, I

о СНОН I! н I

К „С—N—С—СО,Н

Ч/ н

NuCN>

N N

Рибоза

22 N - [N -19- (3- 0-рибофуранозил -пурин-6-ил) карбамоил] треонин (t6A>

г/

Н3С

26 Г^Метилгуанозин (m2G>

Н3С-

NHCO,CH3 I

снсо2сн3 сн2 сн2 о

/ГО

NHC02CH3

снсо2сн3

нсо2н I

сн

СН3

29 Основание "Y" (yW)

30 Основание "парокси Y" (оу W)

'з

NH

Рибоза

19 1 Мет аденозин (т'А|

сн3 о снон

II H | Н3СЧ i-N-C-COjH N Н

Рибоза

23 N - [N- (9- 0- 0-рибофуранозил -пурин-бил) N- метилкарбамоил] траонин 16А О

нч .сн,-сн=с

^N

Рибоза

20 Г^изопентениладенозин (t6A> СН3 О СНОН Hv _,С—NH—С-Н СН2ОН

CONH—С—СН2ОН СН2ОН

N

н3сч

НзС'

N^N^N H2N-^N^N

I

Рибоза

24 N - [N-[(9-0- 0-рибофуранозил-6-ил)-карбамоил] траонил] 2-амидо-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол

о сн.

Рибоза

28 7-Метилгуанозин (m7G) ОН

OR

СН3

31 Основание "Yt"(W)

II ^ H2N--^N^N

Рибоза

32 R - НШкьюозин.или Quo )46 R - fl- D-маннозил (мэн Q)35 R -p-D-галактозил (гал О}35

200

Глава 7

С4.—С5, оказывается менее выраженным, чем в р-нуклеозидах. С точки зрения межмолекулярных взаимодействий это означает, что основным фактором, удерживающим гидроксильную группу в ск-ориентации, является взаимодействие 05. ---Н—С(основание), о котором мы уже говорили в разд. 4.9. С другой стороны, спектроскопические данные для а-нуклеозидов свидетельствуют о наличии небольшого гош-эффекта (разд. 4.12): заселенность трех заторможенных конформационных областей для связи С4,—С5. такова, что торсионный угол 04.—С4.—С5,—Os. несколько чаще оказывается в + ск-области, чем в an. Такая же картина наблюдается при замене основания атомом Н или О—СН3-группировкой [233а].

7.4. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОСНОВАНИЯ: АЛКИЛИРОВАНИЕ АМИНОГРУПП (ЦИТОКИНИНЫ) И ЭНДОЦИКЛИЧЕСКИХ АТОМОВ АЗОТА, ТИОКЕТОЗАМЕЩЕНИЕ, ДИГИДРОУРИДИН, ТИМИНОВЫЕ ДИМЕРЫ, АЗА НУКЛЕОЗИДЫ

Модифицированные основания встречаются чаще, чем модифицированные сахара. Возможно, это связано с тем, что сахарофосфатный остов в составе полинуклеотидов играет роль стержня, на который в строго определенных местах насажены функциональные основания, и потому любая его модификация будет нарушать эту схему.

Много модифицированных оснований обнаружено в тРНК (рис. 7.6) [589, 590, 667-669]. Чаще всего происходит алкилирование аминогрупп аденина, гуанина и цитозина; алкилирование эндоциклических атомов азота Nt аденина, N7 гуанина и N3 цитозина; замена кетогрупп тиоке-тогруппами; насыщение двойной связи С=С в 5,6-дигидроурациле и образование С-гликозидной связи в псевдоуридине.

Особый интерес представляют продукты алкилировання аденина, известные под названием цитокининов; они являются гормонами растений и играют важную роль в регуляции их роста и развития [670, 671]. Во всех активных цитокининах с аминогруппой аденина связан алифатический или ароматический заместитель с двойной связью между Р- и у-атомами боковой цепи (рис. 7.7). Кристаллографическое исследование цитокининов и сходных с ними минорных нуклеотидов тРНК показало, что во всех случаях заместитель при атоме N6 располагается дистально по отношению к имидазольному кольцу, вероятно, из-за того, что при проксимальной ориентации будет происходить перекрывание с атомом N7 [672-677]. Такая конформация, однако, не позволяет атому Nj выступать в качестве акцептора, а атому N6 в качестве донора водородной связи при уотсон-криковском спаривании, и основания образуют хугстеновские пары. Еще одной особенностью цитокининов является то, что плоскость пятичленного кольца почти перпендикулярна плоскости основания (рис. 7.7). Если такая геометрия блокируется введением какого-

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды

Рис. 7.7. Вверху: структурные формулы некоторых цитокининов. У всех цитоки-нинов имеется двойная связь между Р- и у-атомами боковой группы, связанной с аминогруппой аденина. Зеатин и 6-(у,у-диметилаллиламино)-пурин (2iP) содержатся в растениях, кинетин и 6-бензиламинопурин (БАП)-это синтетические цитокинины [670]. Внизу: молекулярная структура кинетина. Плоскость пятичлен-ного кольца практически перпендикулярна плоскости адениновой части молекулы. Обратите внимание, что атом N, не может участвовать в уотсон-криков-ском спаривании, однако «хугстеновские группы» свободны. Двойные связи р—у 8—е обозначены тройными линиями [673].

либо объемного заместителя, то активность цитокининов резко падает [673].

Несколько иная ситуация наблюдается в минорном иуклеотиде тРНК с гипермодифицированиым аденином, N- [^У-(9-|3-/)-рибофуранозилпурин-6-ил)карбамоил]треонином, (?6А). Согласно кристаллографическим данным, боковая цепь в этом соединении тоже располагается дистально по отношению к атому азота N7 аденина, а амидная NH-группа прини-

202

Глава 7

Рис. 7.8. Молекулярная структура М-[№(9-Р-0-рибофуранозилпурин-6-ил)карба-моил]треонина (t6A), одного из минорных нуклеозидов тРНК (его структурная формула приведена на рис. 7.6) [674]. Разветвленная водородная связь (пунктир) фиксирует боковую группу в одной плоскости с кольцом аденина. Уотсон-кри-ковское спаривание исключается, могут образовываться лишь хугстеновские пары.

мает участие в образовании разветвленной водородной связи с атомом Nj аденина и с гидроксилом треонина, выступающим в роли акцептора [674] (рис. 7.8). Такое взаимодействие приводит к компланарности аденина и атомов боковых групп, и только концевые карбоксильная и метальная группы выступают из этой плоскости.

Экстраполяция этих данных на случай Л74-ацетилцитидина, входящего в состав тРНК, позволяет предположить, что ацетильная группа располагается проксимально по отно