. Такие кооперативные переходы (В->А или С->А) происходят также при изменении полярности среды, например при добавлении в систему этанола, изопропанола или диоксана до концентраций ~ 80% [839].

Вода и нуклеиновые кислоты

397

Специфические взаимодействия «катион-ДНК» в 80%-ном метаноле.

В водных растворах катионы взаимодействуют с двойными спиралями В-семейства неспецифическим образом. Однако в растворе, содержащем 80% метанола, взаимодействие становится специфичным. Так, для ДНК в комплексе с ионами Cs+ угол спирального вращения равен 45* (D-ДНК), а в комплексе с ионами Li+ -33° (В'-ДНК), что, по-видимому, объясняется точным пространственным соответствием между гидра тированными катионами различной геометрии и узким желобком двойных спиралей В-семейства [839, 1162].

В водных растворах В-ДНК немного раскручена. Спектры КД и эксперименты по рентгеновскому рассеянию [1163] свидетельствуют о том, что в растворе число нуклеотидов на виток ДНК в В-форме не равно в точности 10, как в волокнах, исследованных методами рентгеновской дифракции (гл. 10). В-ДНК в растворе немного раскручена, угол спирального вращения у нее меньше, чем у В-ДНК в волокнах, что согласуется с теорией, кристаллографическими данными и с результатами экспериментов по ферментативному расщеплению, о которых говорилось в разд. 9.2.

Стабилизация структуры В-ДНК с помощью полиаминов. Двойные спирали В-типа можно стабилизировать, добавив в раствор протамины или гомополипептиды - полилизин или полиаргинин [1164]. Такие основные гомополимеры образуют с ДНК комплексы, располагаясь, по-видимому, в минорном желобке и связываясь, подобно полиаминам спермину и спермидину (разд. 15.6), с фосфатами противоположных цепей [1165 1167]. У двух упомянутых полиаминов, а также у род-

220 260 300 220 260 300 220 260 300 нм

Рис. 17.4. Общая форма спектров кругового дихроизма А-, В- и С-ДНК [839]. 'Пунктиром показано положение максимума УФ-спектров поглощения

398

Глава 17

ственных им путресцина и кадаверина (схема 15.1) различаются расстояния N+.....N + , поэтому они стабилизируют разные структурные

формы ДНК. Так, в водных растворах этанола спермин и спермидин предпочитают связываться с А-формой, тогда как кадаверин или пу-тресцин-с В-формой [1165].

Эти данные, полученные для растворов этанола, находятся в противоречии с результатами структурного исследования комплекса додекамера В-ДНК со спермином, который кристаллизовали в растворе, содержащем высший спирт (2-метил-2,4-пентандиол) [1168]. В двойной спирали, образованной додекамером d(CGCGAATTCGCG) (разд. 11.2), молекула спермина располагается в главном желобке и ориентирована почти перпендикулярно оси спирали, т.е. совсем не так, как предполагалось выше [1165-1167]. Кроме двух солевых мостиков между концевыми аминогруппами спермина и фосфатами противоположных полинуклеотидных цепей одна из внутренних аминогрупп спермина образует водородную связь с выступающим в главный желобок атомом Ое гуанина. Один из двух солевых мостиков ослаблен контактами с соседней молекулой додекамера. Таким образом, указанное выше расположение спермина может быть обусловлено упаковкой молекул комплекса в кристалле, и тогда справедливость экстраполяции полученных результатов к условиям в растворе сомнительна. С другой стороны, интерпретация экспериментов, проведенных в растворе, основана на предположении о локализации спермина и его аналогов в минорном желобке, и в свете новых данных ее, по-видимому, следует пересмотреть.

17.3. ДОСТУПНАЯ МОЛЕКУЛАМ РАСТВОРИТЕЛЯ ПОВЕРХНОСТЬ А- И В-ДНК

Сворачивание полипептидов и полинуклеотидов с образованием вторичной и третичной структуры обусловлено тем, что определенные группы атомов, которые у неупорядоченных полимеров контактировали бы с растворителем, при сворачивании цепи оказываются внутри. Для оценки влияния растворителя на укладку полипептидной цепи [525, 1146-1148] была развита концепция доступной поверхности, с помощью которой можно количественно определить соотношение между скрытыми и доступными для молекул растворителями группами атомов [1169, 1170].

Пробный шарик, который катится по поверхности молекулы. Если трехмерная структура макромолекулы известна, ее объемную модель можно представить в виде совокупности вандерваальсовых сфер, центры которых задаются координатами атомов. Если теперь по такой модели прокатить пробный шарик радиусом tw, мы определим поверхность молекулы, доступную для растворителя или любого атома с радиусом tw ; параллельные сечения этой поверхности дадут карту доступной поверхности (рис. 17.5).

Вода и нуклеиновые кислоты

399

Рис. 17.5. Схематическое изображение доступной поверхности молекулы, состоящей из 6 атомов (затенены) [1172]. Вдоль поверхности движется пробный шарик (показан в цвете) радиуса rw, его центр описывает контур доступной поверхности. Такая же процедура проводится для других плоских сечений молекулы, затем путем интегрирования вычисляется площадь доступной поверхности (А2). При увеличении rw атомы, лежащие во впадинах, становятся недоступными.

При образовании двойной спирали ДНК становится более полярной. В двух независимых работах были определены доступные поверхности молекул тРНКРЬе [1171, 1172], А- и В-ДНК [1172]. Если сравнить пло-[щади доступной поверхности полностью вытянутой ДНК и ДНК в А-Цши В-форме, то мы увидим, что при образовании двойной спирали атомы кислорода фосфатных групп остаются почти полностью открытыми, тогда как основания на 80% заслоняются другими атомами. Иными словами, если у раскрученной вытянутой ДНК на долю фосфатов приходится ~ 20% площади поверхности, на долю оснований-50% и на долю Сахаров-30% то у двойной спирали фосфаты занимают 45% площади поверхности, основания-20%, а сахара-35% (рис. 17.6). Таким образом, полярность молекулы ДНК при образовании двойной спирали увеличивается. Такая же картина наблюдается и у белков при образовании глобулярных структур: полярные группы располагаются на поверхности, а неполярные, гидрофобные-внутри.

Доступность поверхности ДНК для растворителя определяет ее свойства в растворе. Если принять rw равным 1,4 А, что соответствует радиусу молекулы воды, то площадь доступной поверхности у А-и В-ДНК окажется почти одинаковой. Однако с увеличением rw (т.е. при рассмотрении гидратированных катионов или боковых групп аминокислот) относительная доступность фосфатов у В-ДНК растет быстрее, чем у А-ДНК, поскольку у В-формы атомы кислорода фосфатных групп экспонированы сильнее. Соответственно атомы углерода У В-ДНК с ростом rw быстрее попадают в скрытую область, чем У А-ДНК (рис. 17.7).

400

Глава 17

ВЫТЯНУТАЯ ЦЕПЬ ДНК

Общая площадь - 173,ЗД2 Общая площадь - 317 2 А2

Рис. 17.6. Вклад различных групп в общую площадь поверхности раскрученной вытянутой ДНК (А) и В-формы ДНК (?>) со случайной последовательностью [1172]. На рис. Б приведены данные как для экспонированных, так и для скрытых групп; площади экспонированной и скрытой поверхностей в сумме дают общую площадь поверхности. При сворачивании в спираль атомы кислорода фосфатных групп остаются экспонированными, а основания оказываются внутри молекулы. Обозначения: ALC-алифатический углерод, AMN-азот аминогруппы, ARC-ароматический углерод, ARN-азот ароматического кольца, BOX-кислород карбонильной группы оснований, РОХ кислород фосфатной группы, SOX-кислород сахарного остатка.

Эти результаты можно объяснить следующим образом [1172]. Пересечение кривых на рис. 17.7 означает, что для молекул воды площадь доступной поверхности у А- и В-ДНК фактически одинакова, следовательно, первичные гидратные оболочки обеих форм количественно эквивалентны. Из хода кривых при увеличении rw видно, что для кластеров молекул растворителя более доступны фосфатные группы В-ДНК, так как в отличие от А-формы, у которой атомы кислорода фосфатных групп повернуты в сторону минорного желобка и потому менее доступны, в В-ДНК они направлены от оси спирали. Эта общая схема

Вода и нуклеиновые кислоты

401

подтверждается результатами расчета числа молекул воды, которые можно разместить в главном и минорном желобках в окрестности одного нуклеотида 10,5 для А-ДНК и 19,3 для В-ДНК. Последняя величина хорошо согласуется с экспериментально определенным числом молекул воды в первичной гидратной оболочке В-ДНК (~ 20).

Концепция доступной поверхности позволяет объяснить также зависимость конформации ДНК от содержания AT- и GC-nap [1172]. Как показали эксперименты по центрифугированию ДНК в градиенте плотности [1155] и теоретические расчеты [1173], АТ-пара может связать на 1-2 молекулы воды больше, чем пара GC. Если рассмотреть доступную поверхность молекулы, то мы увидим, что у АТ-пары гидрофобная метальная группировка сильно экспонирована и, следовательно, должна способствовать агрегации молекул воды, что предполагает наличие широкого главного желобка. Этим можно объяснить тот факт, что у ДНК с высоким АТ-содержанием переход в А-форму, т. е. в форму с более узким главным желобком, затруднен (см. рис. 9.2). В месте расположения GC-nap оба желобка окаймлены гидрофильными аминогруппами, наличие которых способствует взаимодействию воды с основаниями. Следо-

Рис. 17.7. Зависимость площади доступной поверхности пары оснований poly (dG)- poly (dC) (слева) и poly(dA)- poly(dT) (справа) в А-форме (черная кривая) и в В-форме (цветная кривая) от rw пробного шарика [1172]. / -общая площадь доступной поверхности пары; 2 и 3-вклад в общую площадь атомов кислорода и углерода соответственно. С увеличением rw доступность атомов кислорода фосфатных групп у В-ДНК становится больше, чем у А-ДНК; для атомов углерода наблюдается обратная тенденция.

26 509

402

Г лава 17

вательно, для ДНК с высоким GC-содержанием никакая из структурных форм не будет предпочтительной, и структурные переходы в ней должны происходить легче, чем в АТ-богатой ДНК (см также разд. 17.6).

Доступная поверхность и взаимодействие между ДНК и белками. Как

показывают оценки площади доступной поверхности ДНК для пробного шарика радиусом ЗА и более, основания В-ДНК открыты главным образом со стороны главного желобка (экспонированы N4-aTOM цитозина и метальная группа тимина), а основания А-ДНК - со стороны минорного (N2-aTOM гуанина). Это означает, что при взаимодействии белка с интактной двойной спиралью специфические контакты между парами оснований и боковыми группами аминокислот в случае В-формы будут осуществляться в главном желобке, а в случае А-формы-в минорном. Это согласуется с данными о взаимодействии В-ДНК со специфическими белками: РНК-полимеразы Е. coli с /ас-промотором, /ас-penpeccopa с /ас-Оператором [1172], а также с данными по Х- и cro-репрессорам и взаимодействию ДНК с гистонами в нуклеосо-мах (гл. 18 и разд. 19.3).

17.4. теоретические построения

«Статическая» и «динамическая» модели взаимодействии ДНК с молекулами воды. Для описания гидратации ДНК, РНК и их мономерных составляющих применяются главным образом два теоретических подхода [1173-1178]. Один из них-супермолекулярное приближение-использует метод самосогласованного поля и эмпирические функции потенциальной энергии и дает детальную статическую картину гидратации молекулы [1173-1176]. В другом используется метод Монте-Карло, при этом с помощью карт электростатического потенциала макромолекулы вычисляют статистическое распределение молекул воды и получают динамическую картину взаимодействия с растворителем [1177-1180].

Сопоставление с экспериментальными данными. Метод Монте-Карло позволил определить положение и ориентацию отдельных молекул воды, взаимодействующих с молекулой нуклеиновой кислоты и с другими близлежащими молекулами воды. Оказалось, что в случае двойной спирали ДНК первичная гидратная оболочка имеет характерную структуру с периодом, равным расстоянию между фосфатами. Между каждыми двумя соседними фосфатами одной цепи образуется мостик из молекулы воды. Вблизи POJ-группы располагаются также другие молекулы воды, взаимодействующие одновременно с обоими атомами кислорода Р02-группы. В целом каждый фосфат удерживает по 6 молекул воды первичной гидратной оболочки, что согласуется с результатами ИК-спектроскопии (разд. 17.1). Распределение остальных молекул воды в первичной гидратной оболочке зависит от того, какой тип ДНК рассматривается-А или В. В модели гидратной оболочки В-ДНК предпо-

Вода и нуклеиновые кислоты

403

лагается наличие водных нитей, связывающих фосфаты противоположных цепей через главный желобок [1180]. Энергия стабилизации в данном случае составляет 15 ккал-(моль воды)-1, т.е. настолько велика, что вокруг ДНК образуется второй и даже третий гидратные слои, нто увеличивает общий радиус (гидратированной) ДНК на 6 А в случае двух слоев и на 9 А в случае трех. Молекулы воды, располагающиеся внутри главного и минорного желобков между сахарофосфатными цепями, связаны с ДНК слабее; энергия стабилизации для них составляет ~ 10 ккал-(моль воды)"1 [1177, 1179].

Согласно методу супермолекулярного приближения, с каждой фосфатной группой В-ДНК связывается 5 молекул воды, причем одна из .них сильнее, чем остальные четыре (энергия стабилизации на 4 ккал-моль-1 больше [1175]). В случае GC-пары в главном желобке располагаются 3 молекулы воды, связанные с атомами кислорода кетогрупп и атомами азота аминогрупп гуанина и цитозина; еще 3 молекулы воды находятся в минорном желобке и связываются с атомами 04- сахара, N3 гуанина и 02 цитозина. Таким образом, на каждый нуклеотид в среднем приходится ~ 8 молекул воды, которые образуют внутреннюю гидратную оболочку, что в целом согласуется с приведенными выше данными (разд. 17.1).

Как влияет гидратация на энергию стабилизации двойной спирали В-ДНК? Для анализа сил, ответственных за стабилизацию двойной спирали, можно использовать модель гидратации ДНК, полученную методом супермолекулярного приближения [1175]. Вклад гидратации в стабилизацию двойной спирали связан в основном с уменьшением отталкивания между соседними отрицательно заряженными фосфатами {15 ккал -(моль пар)-1]. Кроме того, при гидратации усиливается притяжение между основанием и фосфатной группой (12 ккал-моль-1) и заметно изменяется стэкинг соседних оснований (7-10 ккал-моль-1).

Какие силы участвуют в стабилизации? Ослабление отталкивания фосфатов обусловлено в первую очередь уменьшением электростатических сил и лишь в небольшой степени увеличением энергии поляризации. Усиление притяжения между фосфатами и основаниями также определяется главным образом существенным увеличением электростатической составляющей и лишь в небольшой мере сопутствующим увеличением энергии поляризации и дисперсионной энергии. Наконец, стабилизирующее действие гидратации на стэкинг в основном связано 'с электростатическим и дисперсионным взаимодействием. Роль поляризации по оценкам невелика, вклад отталкивания в энергию образования Стэкинга составляет 5 ккал-моль-1, а суммарный энергетический выигрыш-7-10 ккал-моль-1 (для GC-пары).

В стабилизации структуры А-РНК принимает участие О 2 -гидроксил. Как показали расчеты, в А-РНК гидроксильная группа 02.—Н может участвовать в трех типах