к; связываясь с кором, ДНК конденсируется и формирует плотно упакованные витки (рис. 19.3) [1313]. Таким образом, в клетках прокариот, как и в ядре эукариот, хромосомная ДНК тоже связана с основными белками и РНК [1314а].

В клетках эукариот хромосомная ДНК в комплексе с гистонами образует хроматин. В клеточном ядре эукариот, объем которого приблизительно такой же, как и объем всей бактериальной клетки, содержится раздо большее количество ДНК, поэтому ее структурная организация том случае существенно сложнее. В соматических клетках различных организмов содержится от нескольких единиц до нескольких десятков хромосом. В клетках человека, например, присутствует 46 хромосом, каждая из которых содержит молекулу ДНК со средней длиной 4 см. Ее-

470

Глава 19

Рис. 19.3. Хромосома клеток прокариот, например Е. coli, содержит единственную кольцевую молекулу ДНК, сверхспирализо ванную и упакованную в компактную структуру вокруг кора, содержащего РНК и белок [1313].

ли все молекулы клеточной ДНК сложить одну за другой, то получится нить длиной ~2м; суммарная мол. масса ДНК составляет 4-1012, что эквивалентно 5,5 -109 пар оснований (дополнение 19.1; рис. 1.4).

ДНК в хромосомах эукариот связана с РНК и белками. Среди этих белков следует выделить гистоны-основные белки, выполняющие в хроматине структурную функцию; весовое отношение ДНК/гистоны в хроматине равно ~ 1. Кроме гистонов в хромосомах содержатся другие, главным образом кислые белки; для них весовое соотношение ДНК/белок колеблется от 0,5 до 1,5 в зависимости от типа клетки и ее физиологического состояния.

Комплекс ДНК с гистонами обычно называют хроматином. Вначале предполагали, что ДНК в хроматине покрыта равномерным слоем гистонов [1315]. Однако, судя по электронным микрофотографиям, это не так. Гистоны в хроматине образуют небольшие глобулярные частицы диаметром ~ 100 А, которые располагаются вдоль молекулы ДНК на расстоянии 30-70 А друг от друга. Эти частицы, которые называют ну-клеосомами [1316] или v-частицами [1317], содержат 5 разных типов гистонов. Пары молекул гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4 образуют окта-

Более высокие уровни структурной организации ДНК

471

Дополнение 19.1

Интерфазные н метафазные хромосомы

В зависимости от стадии жизненного цикла эукариотической клетки ДНК в ней может присутствовать в виде двух основных, макроскопически различающихся форм. В одной форме ДНК лишена определенной макроструктуры и занимает фактически все клеточное ядро; это означает, что клетка находится в интерфазе -состоянии, в котором происходит репликация и транскрипция. Вторая, конденсированная форма ДНК, существует гораздо более короткое время, на стадии деления клетки (митоз, метафаза), и имеет характерный вид, показанный на рисунке.

Электронная микрофотография хромосомы 12 человека. Такая хромосома состоит из хроматина, уложенного в волокна диаметром 200-300 А и длиной 700-800 мкм, и содержит двухцепочечную ДНК общей длиной около 4 см М314].

472

Глава 19

мер [1318, 1319], на который навита цепь ДНК; с каждым гистоновым октамером связаны почти два левых сверхвитка ДНК [1321]. Места «входа» и «выхода» ДНК скреплены гистоном HI, который, по-видимому, локализован с наружной стороны нуклеосомы, на ДНК [1322-1330] (дополнение 19.2).

Дополнение 19.2

Общие свойства гистонов

Гистоны-это белки, содержащие в большом количестве основные аминокислотные остатки. С-концевые участки гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4 являются гидрофобными, а N-концевые-гидрофильными (основными); считается, что гидрофобные участки гистонов имеют выраженную вторичную (спиральную) структуру. Гистон HI по своим свойствам отличается от остальных гистонов; он имеет другую молекулярную массу и связывается непосредственно с ДНК, тогда как остальные четыре гистона образуют октамер, содержащий по 2 молекулы гисто-на каждого типа. Молекула ДНК обвивается вокруг этого октамера, формируя 3

1— левых сверхвитка [1330].

Молекулярные свойства гистонов [1330]

Число аминокислотных остатков

Гистон Мол. масса всего основных" Lys Arg

HI 22000 220 65 62 3

Н2А 14000 129 30 14 12

Н2В 13 800 125 30 20 8

НЗ 15300 135 33 13 18

Н4 11300 102 26 11 14

" Lys, Arg и His.

19.4. СТРУКТУРА НУКЛЕОСОМНОЙ КОР-ЧАСТИЦЫ

Если метафазную хромосому суспендировать в среде с низкой ионной силой, то она разворачивается и принимает форму, по виду напоминающую нитку бус. В зависимости от организма и типа клетки в такой хромосоме на каждую нуклеосому приходится в среднем 180-250 пар оснований ДНК, причем чаще всего имеет место соотношение «одна ну-клеосома на 200 пар ДНК»» [1318, 1327]. После обработки микрококковой нуклеазой и последующей очистки из хроматина удается выделить нуклеосомные частицы без гистона HI, содержащие фрагмент ДНК длиной 146 + 1 пар оснований, которые называют нуклеосомным кором [1332].

Более высокие уровни структурной организации ДНК

473

Взаимное расположение восьми молекул гистонов в такой частице более или менее известно. Эксперименты по самосборке гистоновых молекул в растворе и химическому сшиванию получающихся комплексов показали, что центральным кором октамера является легко образующийся тетрамер Н32, Н42; кроме него образуются также прочные дилеры (Н2А, Н2В) и (Н2В, Н4) и слабосвязанные димеры (Н2А, Н4) и (Н2В, НЗ) [1323, 1327, 1330]. Гистоновый октамер по форме напоминает сердце (рис. 19.4 и 19.5); центральную и нижнюю его части образует тетрамер Н32, Н42, а верхние выступы-два димера (Н2А, Н2В) Т1330]. Октамер, по-видимому, стабилизируется гидрофобными взаимодействиями между С-концевыми участками гистонов (дополнение 19.2), ^ богатые аргининовыми и лизиновыми остатками N-концевые участки располагаются на поверхности октамера и связываются с ДНК, которая •обвивает гистоновый кор, образуя около двух левых сверхвитков.

Нуклеосомные кор-частнцы образуют монокристаллы н агрегаты ду-гообразной и спиральной формы. Нуклеосомные кор-частицы, содержа-лцие фрагмент ДНК длиной в 146 пар оснований, могут образовывать микрокристаллы; электронно-микроскопические исследования этих кристаллов дают представление об общих размерах нуклеосом [1327]. Однако в тех же условиях, при которых происходит кристаллизация, образуются также агрегаты нуклеосом цилиндрической и дугообразной формы; при этом в цилиндрических агрегатах нуклеосомные частицы ^уложены в спиральную структуру. По данным электронной микроскопии во всех этих структурах каждая отдельная нуклеосома имеет вид компактного толстого бочонка высотой 57 А и диаметром 110 А. Поскольку при агрегации нуклеосом образуются дугообразные структуры , разной кривизны, можно предположить, что либо сами нуклеосомные , кор-частицы обладают достаточной гибкостью, либо при агрегации изменяется характер межмолекулярных взаимодействий и это приводит I к изменению кривизны. Кроме того, само существование агрегатов сви-, детельствует о том, что нуклеосомные кор-частицы имеют тенденцию слипаться друг с другом, причем слипание идет главным образом по торцам бочонков [1331].

Если в мягких условиях расщепить нуклеосомный кор протеазами, 'получатся частицы, которые сохраняют первоначальную форму и дают >при кристаллизации достаточно большие, пригодные для рентгено-' структурных исследований кристаллы. Для этих кристаллов с помощью , дифракции рентгеновских лучей и нейтронов в сочетании с электронно-> микроскопическими методами были получены карты электронной плотности с разрешением 20 А [1332, 1333] (рис. 19.4).

Нуклеосомная кор-частица, состоящая из гистонового октамера н на-

битых на него левых сверхвитков (1 — ] ДНК, обладает симметрией 2-го

порядка. Судя по картам электронной плотности, нуклеосомный кор имеет форму сплюснутого клиновидного цилиндра (с размерами, указанными выше), который состоит из двух четко разграниченных поло-

ДНК + белок

Более высокие уровни структурной организации ДНК

475

вин (рис. 19.4). С помощью метода вариации контраста, в котором используются растворы с различным соотношением D20/H20 [чтобы поочередно скомпенсировать рассеяние нейтронов на ДНК (65% D20) и на белке (39% D20)], было четко показано, что сам гистоновый окта-

ер по форме напоминает сердце и обвит 1 — витка левой сверхспирали

ДНК с шагом 27 А. Такую же организацию имеют нуклеосомные кор-частицы и в растворе [1320, 1324] (рис. 19.5, 19.6).

Если исходить из того, что ДНК в нуклеосоме находится в В-форме (т. е. имеет диаметр 20 А), то мы получим, что при наружном диаметре нуклеосомной кор-частицы ПО А диаметр сверхспирали ДНК равен ?0 А; это означает, что на один виток сверхспирали ДНК должно приводиться 80 пар оснований. Учитывая эти оценки, а также результаты по расщеплению нуклеосомных коров панкреатической дезоксирибону-клеазой (ДНКазой I), можно сделать вывод, что кор должен обладать [симметрией 2-го порядка [1333-1335] (рис. 19.5). В пользу такого предположения свидетельствуют следующие факты. Во-первых, места предпочтительного расщепления ДНК находятся друг от друга на расстоянии 10 пар оснований, как и следовало ожидать для В-формы ДНК. Во-вторых, места наиболее частого расщепления разделены расстоянием в 80 нуклеотидов, что предположительно соответствует размеру витка сверхспирали. И наконец, локализация мест «частого» и «редкого» расщепления показывает, что для нуклеосомного кора в целом характерно наличие оси симметрии 2-го порядка

При закручивании ДНК вокруг гистоновых октамеров происходит локальное перекручивание двойной спирали. Немного забегая вперед (этот вопрос будет обсуждаться в разд. 19.7, где вводятся понятия порядка зацепления, райзинга и кручения кольцевых ДНК), отметим, что при формировании вокруг гистонового октамера сверхвитков двойная спираль ДНК перекручивается. Был проведен эксперимент, в котором очищенную кольцевую ДНК вируса SV40 инкубировали с гистоновыми ок-тамерами. При образовании нуклеосомных частиц спираль ДНК делала

Рис. 19.4. Результаты, полученные с помощью рентгеновской и нейтронной дифракции, демонстрирующие структуру полного нуклеосомного кора (вверху), одной только ДНК (в центре) и белкового компонента (внизу) [1327]. Верхний нэисунок получен по данным рентгеновской дифракции, остальные-по результатам рассеяния нейтронов с помощью метода вариации контраста, при котором ниспользуются растворы с различным соотношением D20/H20, чтобы поочередно скомпенсировать рассеяние на белке (39% D20, центральный рисунок) и на [ДНК (65% D20, нижний рисунок). Цветной линией показаны границы элементарной ячейки кристалла; цветом выделена также одна из нуклеосомных кор-ча-стиц, которые видны на рисунке в боковой проекции. Обратите внимание, что ' кор-частица имеет клиновидную форму и состоит из двух частей. Распределение

3

плотности для ДНК (в центре) отвечает 1— сверхвитка.

476

Глава 19

Рис. 19.5. Модель нуклеосомного кора, состоящего из гистонового октамера (Н2А, Н2В, НЗ, Н4)2, расположенного в центре, и фрагмента ДНК длиной 146 пар оснований, который навивается на гистоновый октамер, образуя левые сверхвитки. Показана ось симметрии 2-го порядка (слева). Полная нуклеосомная частица содержит фрагмент ДНК длиной 166 пар оснований, который образует два сверхвитка. Гистон HI располагается у края нуклеосомы и скрепляет точки «входа» и «выхода» ДНК (справа).

вокруг каждого октамера почти два оборота, в результате чего в кольцевой молекуле возникало напряжение. Затем ДНК переводили в релак* сированное состояние с помощью топоизомеразы I [1321]. После удаления гистонов была получена кольцевая ДНК с отрицательной сверхспирализацией, причем на нуклеосому приходилось от — 1 до

1 1

— 1 — (в среднем — 1 —) сверхвитка. Из этих данных следует, что на 4 8

виток двойной спирали ДНК, закрученной вокруг гистонового октамера, приходится 10.0 пар оснований и, следовательно, по сравнению с ДНК в растворе, у которой на виток приходится 10,4 пар (гл. 9), она перекручена.

Взаимодействие с гистонами облегчает изгибание ДНК. Обычно считается, что из-за взаимного отталкивания отрицательно заряженных фосфатных групп, расположенных вдоль сахарофосфатного остова, двойная спираль ДНК ведет себя как довольно жесткий стержень [1336, 1337]. Однако теоретические расчеты показывают, что можно плавно обвить ДНК вокруг гистонового кора, не вводя в молекулу изломов, без которых, как предполагалось вначале (гл. 14), указанное закручивание невозможно. В пользу такой точки зрения свидетельствует и то обстоятельство, что основные аминокислоты на N-концевых участках гистонов будут частично нейтрализовать отрицательный заряд фосфатных групп ДНК. С помощью экспериментов по сшиванию можно показать, что гистоны взаимодействуют с двойной спиралью ДНК в основном со стороны главного желобка [1339]; это согласуется с изложенными выше представлениями о доступной поверхности ДНК (разд. 17.3). Как видно из рис. 19.7, все гистоны (за исключением гистона HI) связываются с ДНК таким образом, что нейтрализуют отрицательные заряды лишь с одной стороны двойной спирали; на противоположной

Более высокие уровни структурной организации ДНК

4П

стороне отталкивание зарядов остается прежним, и все это должно способствовать изгибанию молекулы ДНК вокруг гистонового кора [1340].

19.5. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НУКЛЕОСОМ В ВОЛОКНАХ ДИАМЕТРОМ 100 И 300 А. СУПЕРСВЕРХСПИРАЛЬ, ИЛИ СОЛЕНОИД

Из-за больших размеров и сложности компонент нуклеосом и хроматина их структурная организация в хромосомах не является строго регулярной, поэтому для исследования структуры хромосом дифракционные

130

S

-

витка вокруг гистонового октамера [1327]. Диаметр ДНК равен 20 А, наружный Диаметр сверхспирали 110 А, шаг сверхспирали 27 А. На один сверхвиток приходится 80 пар оснований ДНК

гис. 19.6. Показанный крупным планом фрагмент ДНК, образующий 1— сверх-

478

Рис. 19.7. Схема, иллюстрирующая асимметричную нейтрализацию зарядов фосфатных групп на ДНК при связывании с гистонами [1340]. Гистоны изображены в виде черных полосок. Электростатическое отталкивание заряженных фосфатных групп в минорном и главном желобках (жирные и тонкие стрелки) приводит к изгибанию молекулы ДНК, при котором гистоны оказываются внутри структуры.

методы оказываются непригодными. Чтобы хотя бы на макроскопическом уровне изучить строение волокон диаметром 100 и 300 А, которые являются главной составной частью хромосом (рис. 19.8), используют электронно-микроскопические методы [1341].

Структура хроматина, лишенного гистона HI, нерегулярна. После удаления гистона HI при низкой ионной силе нуклеосомы по-прежнему

Рис. 19.8. Соленоидальная структура хроматина [1327, 1341]. В отсутствие гистона HI (в нижней части рисунка) точки «входа» и «выхода» ДНК оказываются на противоположных сторонах нуклеосомы и регулярной структуры не образуется. Гистон HI «скрепляет» нуклеосому, при этом точки «входа» и «выхода» ДНК располагаются уже на одной стороне нуклеосомы. При увеличении концентрации соли нуклеосомы, содержащие гистон HI, образуют спиральную структуру, у которой на виток приходится ЗЧ> нуклеосом (и). При этом гистоны HI группируются в цен