Биологический каталог




Принципы структурной организации нуклеиновых кислот

Автор В.Зенгер

да, которые принимают участие в образовании водородной связи N—Н - ¦ • О, сплющены. Рисунок сделан по программам и данным Кембриджского банка данных [163].

лекул оно обычно не превышает 0,8 А, т.е. атомы, расположенные на расстоянии 1,54 А друг от друга, легко разрешаются (рис. 3.4).

Успешный анализ хорошо уточненной кристаллической структуры позволяет получить значения межатомных расстояний и валентных углов

с точностью 0,005-0,01 А и 0,3-1°. Конформация молекулы задается торсионными углами (гл. 2), точность определения которых составляет 0,8-2°. Размножив операциями симметрии, свойственными данной пространственной группе, содержимое асимметричной части и применив к элементарной ячейке операции трансляции, мы получаем структуру всего кристалла, которая дает представление об упаковке молекул

Методы

51

(рис. 3.6). Эта общая картина позволяет судить о самоорганизации молекулы и о межмолекулярных взаимодействиях-о водородных связях, стэкинге, дипольных, вандерваальсовых и электростатических силах. В настоящее время с помощью рентгеновской кристаллографии можно получить точную структуру молекул с мол. массой, не превышающей 2000 (что соответствует мол. массе гексануклеотида, если принять мол. массу нуклеотида равной в среднем 350).

3.2. РАСЧЕТЫ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ЭНЕРГИИ

Если известна кристаллическая структура молекулы, то мы можем рассчитать ее потенциальную энергию. Особый интерес представляют молекулы с внутренним вращением вокруг межатомных связей. В моно-и полинуклеотидах такое вращение возможно вокруг гликозидных, фосфодиэфирных, а также эндо- и экзоциклических (С4-—С5') связей сахарного кольца.

При расчетах потенциальной энергии внутреннего вращения варьируют один или несколько параметров в определенных интервалах и рассчитывают расстояния гу между атомами i, j. Первые такие расчеты были основаны на допущении, что на расстоянии гу > г0 притяжение

Таблица 3.1. Вандерваальсовы радиусы некоторых атомов, определенные двумя методами: путем измерения расстояния максимального сближения [157] и по Аллингеру [158]

Радиус, А

Лтом максимальное сближение по Аллингеру

Н 1,20 1,50

р (участвующий в образовании оди- 1,52 1,40" 1,65

нарной или двойной связи)

С (в алифатическом соединении) 1,70 1,75 {sp3)

|С (в ароматическом соединении) 1,70 1,85 (sp2, sp)

fi (в алифатическом или ароматиче- 1,55 1,50ч 1,70

. ском соединении)

Р 1,80 1,90" 2,05

=S 1,75 ) 1,85" 2,00

—S — 1,80 J F 1,35" 1,60

Cl 1,80" 1,95

Br 1.951» 2,10

I 2,15" 2,25

" Данные взяты из работы [159]. Эти значения а также значения для Н, С,

полученные путем оценки расстояния максимального сближения, используются наиболее часто.

52

Глава 3

отсутствует, а на расстоянии гу < г0 имеет место бесконечно большое отталкивание атомов друг от друга (г0-это сумма вандерваальсовых радиусов атомов i и j) (табл. 3.1; рис. 3.7) [50-53]. Это приближение «потенциала жесткой сферы» может использоваться для предварительной оценки вращательной свободы молекулы [18, 34, 54]; сегодня, однако, применяются более точные функции потенциальной энергии [55-64].

Вклад в полную энергию взаимодействия Ц,олн между ковалентно несвязанными друг с другом атомами в молекуле вносят дисперсионные силы (лоцдоновское притяжение V„), отталкивание V„, электростатические кулоновские взаимодействия Уэ и потенциалы внутреннего вращения (VBp). Ц, и VQ обычно комбинируются в форме разрыхляющих потенциалов Букингема «а-ехр» либо «6-12» Леннард-Джонса:

Vp= -Ац/г§ + Ву/г12. (3.8)

Параметр Ац зависит от типа атомов i, j, и его можно вычислить из поляризуемости атомов и эффективного числа валентных электронов по формуле Слэтера-Кирквуда [60, 65]. Параметры By можно получить из Aij с учетом суммы вандерваальсовых радиусов двух взаимодействующих атомов i и j (гу). Некоторые из этих величин представлены в табл. 3.2. Эти же величины в модифицированной форме приводятся в работе [63].

Электростатический потенциал для двух заряженных атомов, находящихся на расстоянии ц (А) друг от друга, имеет размерность ккал • моль ~ 1 и может быть аппроксимирован потенциалом простого взаимодействия между зарядами:

Уэ = ЪПеф'гу. (3.9)

Заряды (частичные) е,- и е,- выражаются в единицах заряда электрона е0 с учетом вклада а- и я-связей, рассчитываемого с помощью методов

Рис. 3.7. Потенциал жесткой сферы {слева) и разрыхляющий потенциал «6-12» Леннард-Джонса (справа).

Методы

53

Таблица 3.2. Параметры Ац и By для разных пар атомов г, j, используемые в потенциале «6-12» Леннард-Джонса1'

Пара атомов гты, А Ау, ккал-А6- Вф ккал • А •моль-1

•моль-1 Н—Н 2,40 46,7 4,46-103

н—С 2,90 128 3,80-104

Н—N 2,75 125 2,70-104

Н—О 2,72 124 2,51-104

Н—Р 3,10 346 1,54-10s

С—С 3,40 370 2,86-105

С—N 3,25 366 2,16- 10s

С—О 3,22 367 2,05-105

С—Р 3,60 1000 1,09 -106

N—N 3,10 363 1,61 • 105

О 3,07 365 1,53-10s

N—Р 3,45 990 8,35- 10s

О—О 3,04 367 1,45- 10s

О—Р 3,42 995 7,96-105

Р—Р 3,80 2710 4,08 106

гт!„-это минимальное расстояние между атомами i и j при вандер-ваальсовом взаимодействии. Данные взяты из работы [65], в которой приводится информация о взаимодействиях с участием галогенов.

квантовой химии, например методом самосогласованного поля в приближении ППДП/2 (полное пренебрежение дифференциальным пере-ыванием) [66]. Другие методы оценки зарядов были разработаны юккелем [67] и Дель Ре [68, 69]. Распределение зарядов для нуклеоти-шов приведено на рис. 5.1 [70-72]. Среднее значение безразмерной ди-Ьлектрической постоянной е', учитывающей экранирующее действие растворителя на заряд, обычно принимается равным 3,5-4,0. Наличие вращательных потенциалов

KBp = (K0/2)(H-cosne) (3.10)

(обусловлено обменными взаимодействиями электронов в связях, примыкающих к той, вокруг которой (на угол 6) происходит вращение, а также вандерваальсовыми силами. Целое число и определяет периодичность барьера вращения. Значения V0 приведены в табл. 3.3 [73].

На рис. 4.27 представлена энергетическая карта для взаимодействия между несвязанными атомами в зависимости от торсионных углов. Полная энергия равна сумме энергий отдельных взаимодействий

Кгалн = ^р V) ^вр> (3-11)

и ее часто называют классической потенциальной энергией либо «полуэмпирическим потенциалом».

54

Глава 3

Таблица 3.3. Примерная высота барьера вращения V»

Связь, вокруг которой происходит вращение

ккал • моль

С—С 3,11

С—NH2 1,75 С—ОН 0,95

С—N02 0,003 (обычное значение для

вращения вокруг гликозидной связи)

" Подробнее см. работу [73].

В молекулах нередко происходят изменения длин связей и в особенности валентных углов, которые не могут быть описаны данными методами. Такие отклонения от «идеальной» геометрии можно анализировать методом самосогласованного поля (ССП), дающим более реальную информацию о жесткости молекул. Для еще более детального анализа применяют другие методы квантовой химии, такие, как расширенный метод Хюккеля [75, 76], методы ППДП/2 [66] или КВВМО (конфигурационные взаимодействия возмущенных молекулярных орбиталей) [77, 78], а также неэмпирические методы ab initio [79]. Однако неэмпирические методы применимы только для малых молекул размером не более мононуклеотида. Кроме вращательных потенциалов они дают информацию о распределении заряда, о потенциалах ионизации, электростатических потенциалах и дипольных моментах. К большим системам данные методы неприменимы; в этом случае пользуются полуэмпирическими потенциалами или же разбивают большие системы на малые подсистемы, для которых имеются модельные соединения.

3.3. КРИСТАЛЛОГРАФИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ

Кристаллы тРНК с мол. массой 26000 получают из водных растворов добавлением спиртов или соли. Такие кристаллы, как и кристаллы белков, содержат от 30 до 80% растворителя и могут рассматриваться как концентрированный раствор. Из-за слабости межмолекулярных контактов, стабилизирующих кристаллы, они очень чувствительны к изменению окружения, поэтому их хранят при строго определенных условиях [47, 80, 81].

При определении пространственной группы и получении рентгеновских данных используются те же методы, что и в случае малых молекул, однако для решения фазовой проблемы применяется иной подход—метод изоморфного замещения. Он основан на введении в кристалл тяжелых атомов (содержащих примерно по 50 электронов) без нарушения кристаллической решетки. Тяжелоатомное замещение производят либо

Методы

55

с помощью ковалентного сшивания реагента с тРНК, либо путем выдерживания кристаллов в растворах, содержащих такие тяжелые атомы, как Pb2 +, Sm3 +, AUCI4 и т. д. Тяжелые атомы диффундируют в области между макромолекулами, заполненные растворителем, и специфически связываются с определенными участками тРНК. О качестве включения тяжелого атома судят по изменению распределения интенсивностей на рентгенограмме; если присоединение прошло изоморфно, расположение пятен не меняется. Для определения фаз необходимо как минимум два изоморфных производных (либо одно производное и набор данных по «аномальному рассеянию»). Грубые оценки фаз получают по расположению тяжелых атомов в элементарной ячейке [82]; по ним строят карту электронной плотности [уравнение (3.2), дополнение (3.1)], которая и заключает в себе информацию о структуре макромолекулы.

В кристаллах тРНК (и белков) межмолекулярные взаимодействия довольно слабы. Группы атомов находятся в интенсивном тепловом движении, особенно на поверхности молекулы. Иногда они просто не упорядочены, что существенно сужает дифракционное поле (ухудшает разрешение) (рис. 3.5). Самые качественные кристаллы тРНК дифрагируют до разрешения 2,5 А, что отвечает 8000 рефлексам на 1652 неводородных атома. Если уточнять только атомные координаты и изотропный температурный фактор, то и тогда отношение числа рефлексов

m2 Gio

Рис 3.8. Фрагмент _ карты электронной плотности тРНКд|^жжи, полученной • разрешением 2,5 А, на который наложена проволочная модель фрагмента молекулы [164]. Отдельные атомы на карте не разрешаются, поэтому ее интерпретация менее однозначна, чем в случае малых молекул (рис. 3.4).

56

Глава 3

к числу параметров окажется равным единице. Этого явно недостаточно для удовлетворительного уточнения модели структуры (напомним, что для малых молекул это отношение лежит в интервале 10-20). Чтобы обойти эту трудность, можно уточнять параметры не отдельных атомов, а целых группировок (оснований, Сахаров и фосфатных групп), и минимизировать энергию, варьируя торсионные углы при постоянных значениях валентных углов и длин связей, соответствующих их каноническим значениям, которые рассчитаны по структурам малых молекул.

Отдельные атомы на карте электронной плотности тРНК из-за ограниченности дифракционного поля не разрешаются. На карте электронной плотности основания и сахарные остатки имеют вид дисков, а фосфатные группы-вид сфер более высокой плотности. Интерпретация таких карт, т.е. построение по карте молекулярной модели, проводится с помощью компьютерного графического дисплея либо компаратора Ричардса [83]. В последнем случае строят вручную проволочную модель, добиваясь ее соответствия с картой электронной плотности; модель и карту совмещают с помощью полупрозрачного зеркала, которое устанавливают между ними (рис. 3.8). Поскольку все пурины и пиримидины сходны по форме, распознавание участка нуклеотидной последовательности сопряжено с большими трудностями, чем распознавание белковых фрагментов, у которых размеры боковых групп различаются настолько, что можно (по крайней мере частично) установить аминокислотную последовательность на основании одних только рентгеновских данных.

Распределение электронной плотности отдельных участков молекулы, особенно неспиральных, не всегда удается однозначно интерпретировать, и тогда все зависит от интуиции исследователя. Именно этим объясняется тот факт, что разные группы исследователей иногда делают разные выводы о тонких структурных деталях одной и той же молекулы в одном и том же кристаллографическом окружении. Еще одна проблема кристаллографии больших молекул состоит в том, что существующие методы уточнения модели не всегда сходятся к одному и тому же решению, особенно когда дело касается тех участков молекул, которые видны менее четко [84]. В элементарной ячейке кроме макромолекул присутствуют молекулы растворителя, которые из-за своей неупорядоченности не могут быть надлежащим образом учтены (кроме некоторых из них, прочно связанных с поверхностью макромолекулы). Поэтому R-фактор даже для хорошо уточненных кристаллических структур тРНК не сравним с R-факторами для малых молекул и лежит в интервале 0,5-0,30 [85-87].

3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ ВОЛОКОН

Препараты двухцепочечных ДНК и РНК обычно представляют собой гетерогенные наборы молекул. В противоположность глобулярной тРНК, имеющей четкую пространственную структуру, они не могут быть полу-

Методы

57

чены в виде монокристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа. Для ДНК были получены микрокристаллы с разной морфологией [88-91], однако ни для одного из них не удалось провести детальный структурный анализ [91]. Единственным разумным подходом к исследованию структуры полимерных нуклеиновых кислот является приготовление волокон и очень концентрированных вязких гелей, которые получают осаждением нуклеиновых кислот из водных буферных растворов спиртом [92]. Стержнеобразные спиральные молекулы нуклеиновых кислот образуют параллельные квазикристаллические структуры со случайной азимутальной ориентацией молекул относительно оси волокна. Вследствие этой азимутальной неупорядоченности дифракционная картина, полученная с помощью монохроматического пучка, перпендикулярного оси волокна (рис. 3.9), оказывается сходной с рентгенограммой вращения, и ее можно интерпретировать аналогичным образом [93].

Из-за неупорядоченного расположения молекул в волокнах рефлексы имеют вид дуг, а разрешение обычно не превышает 3 А. Рефлексы перекрываются, поэтому количество данных, получаемых по рентгенограммам волокон, довольно ограничено: для определения соответствующей элементарной ячейки может быть использовано от 10 до 100 рефлексов. Все это, а также нарушение кристаллического порядка не позволяют рассчитать распределение электронной плотности на основе одних лишь экспериментальных данных. Тем не менее дифракционная картина содержит достаточно информации для того, чтобы получить грубое представление о структурных особенностях спиральной молекулы. * Расстояние между слоевыми линиями, на которых располагаются рефлексы, равно 1/с (А~ *), где с-это параметр ячейки вдоль оси волокла. Эта повторяющаяся величина для случая спиралей с целым числом нуклеотидов на виток (каковыми являются все природные и синтетические ДНК и РНК [38], кроме ДНК в С-форме [94]) соответствует шагу спирали. Расположение первого меридионального рефлекса в области 2,6-3,8 А предполагает, что именно таким должно быть расстоя

страница 6
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79

Скачать книгу "Принципы структурной организации нуклеиновых кислот" (9.68Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2019)