Подводя итог, мы можем сказать, что потребности любой клетки в питательных веществах определяются ее биосиптетическими возможностями. Если эти возможности велики и разнообразны, то среда для роста может быть простой, а если Они невелики и узкоспециализированы, то среда должпа быть сложной. Вно зависимости от того, синтезируются они в клетке или поступают извне, в конце концов все клетки должны иметь один и тот же набор веществ — Сахаров, аминокислот, пуринов, пиримидинов и т. д. Естественное окружение клетки определяет ее потребности. У клеток, вынужденных жить в условиях постоянного недостатка питательных веществ (почти все бактерии, водоросли и т. д.), биосинтетические возможности должны быть велики и разнообразны. У клеток, обитающих только в богатой питательной среде (простейшие, которые питаются другими клетками, клетки животных, непрерывно омываемые богатой питательными веществами кровью, и некоторые паразитические микрооргапизмы), синтетические возможности ограничены.

Синтез ДНК в цикле роста и деления клетки. ДНК синтезируется все время или только в определенные промежутки времени? Почти все клетки синтезируют ДНК в течение относительно короткого периода, задолго до того, когда хромосомы действительно делятся. Особенно красивое доказательство этому было получено в следующем эксперименте. Диспергированную популяцию опухолевых клеток мыши выращивали в жидкой среде. Для завершения цикла роста и деления в среднем каждой клетке требуется 24 ч. Эти процессы в разных клетках происходят асинхронно, т. е. в любой момент времени одпи клетки только что разделились, другие готовы к делению, третьи находятся на различных промежуточных стадиях. В самом начале эксперимента в среду добавили меченный тритием (3Hi) тимидип. Напомним, что тимидин (дезоксирибозо-тимин) является составной частью ДНК. Через определенные интервалы времени после пачала культивирования с 3Н-тимидином брали пробы клеток и смотрели их под микроскопом. В каждой такой пробе исследовали клетки, находящиеся на стадии мётафазы, и пытались определить, включился ли меченый тимидин в их ДНК (рис. 5-4). Если бы включения не было обнаружено, то это означало бы, что клетки уже удвоили всю свою ДНК еще до начала эксперимента. Если бы включение произошло, то можно было бы сделать вывод, что часть либо вся ДНК данной клетки синтезировалась после добавления меченого тимидипа.

Присутствие 3Н-тимидина в ДНК обнаруживается при помощи метода, называемого «радиоавтографией». Когда радиоактивное соединение распадается, оно в буквальном смысле создает свою собственную фотографию, отсюда и возпикло такое название. Стекла с фиксированными на них клетками подвергают химической обработке для удаления всего тимидина, пе включившегося в ДНК. Затем стекла погружают.в фотографическую эмульсию, дают ей застыть и инкубируют их в темноте (так что атомы трития 1 могут распадаться), проявляют и фиксируют как обычную фотографию. Частица, испускаемая при каждом радиоактивном распаде, восстанавливает в эмульсии одно зерно серебра, как и фотон света. Черное зерно появляется почти точно в месте распада радиоактивного соединения. Затем под микроскопом можно видеть клетку с ядром и над ним одну или несколько черных точек, каждая из которых и есть зерно серебра. Чем больше меченого тимидипа включилось в ДНК, тем больше радиоактивных распадов; чем больше распадов, тем больше черных зерен.

1 Тритий (3Ht) распадается с образованием атомарного водорода (lHt) и испускает так называемую а-частицу, которая состоит из двух избыточных нейтронов, входивших в ядро трития.

Теперь вернемся к эксперименту (рис. 5-4). На рисунке показаны пять клеток в момент добавления 3Н-тимидина. В самом начале

Клетка А

Начало опыта (время введения Щ-тимишна)

5ч

Юн

Метафазные хромосомы

15ч

20ч

ядро

Клетка Б

???.t'i>,--:.-I

Зерна серебра

Клетка В

А. ! .-' • Г'.

эксперимента клетка А находилась на какой-то стадии цикла, а через 5 ч ее ядро вступило в метафазу митоза. Над хромосомами этой клетки не обнаружено зерен серебра, поскольку удвоение ДНК произошло до добавления тимидина. То же самое относится к клетке Б*, которая в момент добавления 3Н-тимидина находилась на несколько более ранней стадии клеточного цикла и достигла стадии метафазы спустя 10 ч. А над метафазными хромосомами

Время, ч

Рис. 5-5. Синтез ДНК в периоде роста и в цикле деления. График построен на основе данных, приведенных на рис. 5-4.

клетки В обнаружено несколько зерен серебра, ядро этой клетки достигло стадии метафазы через 15 ч после начала опыта. Над метафазными хромосомами клетки Г имеется уже большое число зерен серебра, и ее ядро достигло стадии метафазы через 20 ч после начала опыта. Приблизительно такое же число зерен обнаружено над метафазными хромосомами клетки Д. Вывод: клетка В в момент добавления тимидина должна была находиться в фазе синтеза ДНК, а клетки Г и Д должны были синтезировать всю ДНК в присутствии тимидина. Исследование таким способом большого числа клеток и тщательный подсчет зерен серебра позволили получить результаты, суммированные на рис. 5-5 и показывающие, что содержание ДНК в клетке удваивалось точно в течение 6-часового периода. Для удобства исследователи назвали эту часть клеточного цикла ^-периодом. Десятичасовой период, предшествующий синтезу ДНК, называется Gi-периодом, а восьмичасовой период после синтеза ДНК называется <32-периодом. Деление ядра с истинным расщеплением хромосом на метафазной пластинке занимает всего несколько минут, немедленно вслед за этим делится клетка.

Рис. 5-6. Ресничная инфузория. I — реснички, 2 — макронуклеус, 3 — микронуклеус, 4 — глотка.

Синтез ДНК изучали во многих клетках эукариотов, применяя различные методы. Было обнаружено, что продолжительность -5-периода варьирует от вида к виду, но обычно занимает относительно небольшую часть цикла. Продолжительность периодов G\ и &2' также значительно варьирует, так что в некоторых клетках синтез ДНК начинается вскоре после митоза, а в других — значительно позднее.

Бактерии, по крайней мере некоторые, вероятно, представляют исключение. Например, у Е. coli1 отсутствуют G\- и (^-периоды, т. е. нет перерывов между последовательными циклами удвоения ДНК и S-период продолжается в течение всего цикла.

1 Отсутствие Gi-периода отмечепо также для некоторых клеток оукарио-тов. Например, во время дробления яйцеклетки морского ежа синтез ДНК начинается в телофазе митоза. — Прим. перев.

Регуляция синтеза ДНК. Вероятно, наиболее четко способность клетки регулировать синтез ДНК во времени, в пространстве и в

количественном отношении была показана на представителе ресничных инфузорий — Euplotes. Эта инфузория, изображенная на рис. 5-6, имеет микронуклеус и длинный лентообразный макронуклеус. Микронуклеус делится митотически. Макронуклеус, содержащий большое число копий каждой .хромосомы, делится амиКроме того, синтез ДНК в макронуклеусе регулируется также в пространстве и во времени (рис. 5-7). В начале периода синтеза ДНК на противоположных концах макронуклеуса появляются две полоски, они смещаются к центру ядра с одинаковой скоростью. В области полосок -концентрация ядерных материалов резко отличается от соседних областей; благодаря этому они и заметны. Полоски встречаются в середине макронуклеуса через 10 ч, т. е. в то время, когда завершается синтез ДНК. Полоски представляют собой зоны синтеза ДНК. Таким образом, вся ДНК за полосками уже редуплицирована, в центральных отделах перед полосками — еще нет, а в самих полосках происходит редупликация.

®

Пул исходных ^ОмпШщшАрфт I №"^7^^

продуктов Цитозиндезоксирибофосфат Г и полимераза

Тшиндезоксирибофосфат J

Рис. 5-8. Синтез ДНК и уровни его регуляции.

Синтезы РНК и ДНК в макронуклеусе взаимно исключают друг друга: синтез РНК происходит во всех участках макронуклеуса, за исключением тех областей, где в да*нный момент синтезируется ДНК.

На рис. 5-8 дана схема синтеза ДНК. Непосредственными предшественниками ДНК являются дезоксирибозидтрифосфаты четырех пуриповых и пиримидиновых оснований.

Л priori можно представить себе четыре уровня, на которых может контролироваться синтез ДНК. Вот они:

1. Снабжепие предшественниками. Если бы предшественники были доступны только в определенные периоды митотического цикла, то и синтез ДНК мог бы происходить только в эти периоды.

2. Активность полимеразы. Если бы сам фермент был доступным только в определенные периоды митотического цикла, то синтез ограничивался бы этими периодами.

3. Физическое состояние матрицы ДНК. Известно, что в пробирке ДНК должна находиться в особом физическом состоянии; только в этом случае она может служить матрицей для синтеза ДНК. Таким образом, регуляция синтеза новой ДНК могла бы заключаться в измепении физического состояния старой ДНК.

4. Регуляция с помощью самой ДНК. Некоторые свойства вновь сиптезированпой ДНК могли бы ограничивать ее дальнейший синтез.

Синтез белка в клеточном цикле. Если измерять общее содержание белка в клетке на протяжении цикла роста и деления, то оказывается, что оно всегда равномерно и непрерывно увеличивается (рис. 5-9). Скорость синтеза новых белков в некоторых клетках может быть несколько выше в начале цикла, чем в его конце, по неизменным остается тот факт, что белки синтезируются на всех стадиях цикла, за исключением очень короткого периода митоза.

Рис. 5-9. Динамика биохимических процессов в клеточном цикле

дрожжей.

1 — число клеток, 2 — общее содержание РНК, 3 — общее содержание белка, 4 — активность щелочной «росфатазы, 5 — активность а-гликозидазы.

1 Эти культуры синхронизированы в лаборатории с помощью специальной обработки; в течение ряда генераций их клетки делятся в одно и то же время и проходят абсолютно синхропно остальной цикл. Излюбленный метод получения синхронных культур — отбор из асинхронных культур всех клеток определенного размера (самых мелких или самых крупных). Отобранные клетки — новую гомогенную популяцию — переносят на питательную среду. Они в течение нескольких генераций продолжают синхронно расти до те