х пор, пока постепенно снова не становятся асинхронными.

Что известно о синтезе отдельных белков, т. е. различных ферментов, компонентов мембран, гистонов, белков, рибосом и т. д.? В одном из наиболее иптересных исследований были использованы синхронные культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae К На протяжении цикла с определенным интервалом брали пробы синхронно растущей популяции клеток и определяли в них содержание ферментов. Ни один из ферментов, по-видимому, не синтезировался непрерывно в течение всего цикла. Напротив, количество каждого фермента в расчете на клетку резко возрастает. Это показано на примере синтеза фермента а-глюкозидазы [рис. 5-9; этот фермент расщепляет дисахарид мальтозу (глюкозо-1,4-а-глюкозид) на две молекулы глюкозы]. Уровень этого фермента остается постоянным в течение первой половины цикла и немного дольше, а затем резко возрастает. Высокий уровень синтеза сохраняется до тех пор, пока не накапливается количество фермента, достаточное для двух клеток — материнской и дочерней. В противоположность этому в синтезе щелочной фосфатазы (этот фермент выполняет в клетке функцию «мусорщика» — он выщепляет неорганический фосфат из органических фосфатов и более активен при высоких рН) существуют два разных пика, причем каждый раз синтезируется приблизительно одинаковое количество фермента. У S. cerevisiae имеются два структурных гена для щелочной фосфатазы, локализованных в разных хромосомах. Резкое увеличение уровня других ферментов происходит в разные периоды цикла.

читателю пари, что

новремепно, а в разное

Таким же способом необходимо исследовать синтез белков во многих других типах клеток, прежде чем сделать вывод о том, что на протяжении цикла все клетки синтезируют разные белки не одименно так и происходит в цикле других клеток. Ранее я подчеркивал точную количественную регуляцию процессов, происходящих в течение цикла при длительном росте "клеточной популяции: клеточные компоненты создаются в нужных количествах и распределяются более или менее равномерно между дочерними клетками. Если важно синтезировать все вещества в строго определенных количествах, то мне кажется, что для клетки было бы значительно легче синтезировать нужное количество одного вещества, забыть об этом и перейти к синтезу следующего, чем синтезировать все сразу и все время регулировать все эти синтезы.

Синтез РНК и ее транспорт во время клеточного цикла. Растущая клетка в течение всего цикла деления синтезирует РНК, поэтому общее содержание РНК в клетке увеличивается плавно и непрерывно, точно так же, как и содержание белка (рис. 5-9). Как уже было показано в гл. 3, вся эта РНК, вероятно, синтезируется с помощью фермента РНК-полимеразы на ДНК-матрице, Это означает, что синтез всей РНК должен происходить в непосредственной близости от ДНК, т.е. главным образом в ядре, которое содержит основную массу ДНК, а также в митохондриях, а в клетках растений и водорослей еще и в хлоропдастах, содержащих остальную часть ДНК клетки.

Где в живой клетке находится РНК? Почти вся она сосредоточена в цитоплазме, а не в ядре. При обработке клеток красителями, которые специфически связываются с РНК, наиболее интенсивно окрашивается именно цитоплазма. Если клетки осторожно разрушить мягкой механической обработкой или обработкой определенными детергентами, то ядра не повреждаются; из разрушенных клеток можно выделить ядра, митохондрии (и хлоропласты),

Рис. 5-10. Дипамика синтеза и транспорта РНК и белка.

А. РНК: 1 — в ядре, 2 — в цитоплазме. Стрелкой указан момент добавления 3Н-урацила. Б. Белок: 1 — в ядре, 2 — в цитоплазме. Стрелкой указан момент добавления 3Н-лейцина.

фрагменты клеточных мембран и цитоплазму. В цитоплазме находится почти вся РНК (обычно 80—90%). Следовательно, синтезированная в ядре РНК затем должна перейти в цитоплазму1 (рис. 5-10). Проследить миграцию вновь синтезированной РНК из ядра в цитоплазму можно в опыте культивирования растущих клеток с меченым урацилом, пиримидиновым предшественником РНК, и при этом можпо также определить, какие типы РНК мигрируют и в каких количествах.

1 РНК, синтезированная в митохондриях и хлоропластах, также попадает в цитоплазму, но природу этих РНК только начинают исследовать и о ней еще мало известно.

Даже у бактерий и сипе-зеленых водорослей, у которых нет оформленного ядра, окруженного ядерной мембраной, существует сложный путь миграции РНК от места синтеза к другим участкам клетки.

Так как основная, если не единственная функция РНК — направлять и ускорять синтез белка, следовательно, почти весь, если не весь вообще, синтез белка должен происходить в цитоплазме, где находится вся РНК. Действительно, как показано в опытах,

Тяжелые Легкие Моносомы

полисомы полисомы

Рис. 5-11. Профиль рибосом в клетках на стадиях метафазы и

иптерфазы.

1 — клетки на стадии метафазы, 2 — клетки на стадии интерфазы.

сходных с изображенным на рис. 5—10, весь синтез белка происходит в цитоплазме, а не в ядре. Даже такие белки, как гистоны, обычно находящиеся в ядре, должны синтезироваться в цитоплазме, а затем транспортироваться в ядро. Это означает, что движение между ядром и цитоплазмой двустороннее.

Рибосомная и транспортная РНК, составляющие соответственно около 85 и около 10% общего количества РНК, синтезируются, вероятно, в течение всего цикла. То же самое относится ко всей мРНК в целом. Что же касается индивидуальных мРНК, каждая из которых транскрибируется со своего определенного гена, то пока не ясно, транскрибируются все они непрерывно или в определенной временной последовательности.

Завершение одного цикла роста, и деления. Получают синхронно растущую популяцию клеток HeLa. В середине каждого цикла, когда ядра находятся в интерфазе, отбирают пробу клеток, разрушают их в щадящих условиях, цитоплазму быстро собирают и центрифугируют при высокой скорости. Скорость, время и условия центрифугирования 1 подбирают таким образом, чтобы ноли-сомы распределились в центрифужной пробирке так: па дне самые крупные, в узкой зоне, наверху, — моносомы. Профиль рибосом в иптерфазпых клетках показан на рис. 5-11. Оказалось, что в полисомных комплексах находится около 90% рибосом и только 10% —в свободном состоянии. Именно такого распределения и следовало ожидать, если учесть, что клетки в это время синтезируют белок, до предела используя свои возможности.

Другую пробу клеток берут в конце каждого цикла, когда ядра находятся на метафазе и вот-вот разделятся; профиль рибосом па этой стадии также изображен на рис. 5-11. Полисом практически нет, все рибосомы находятся в свободном состоянии (моносомы). (Небольшое количество оставшихся полисом объясняется тем, что практически невозможно полностью синхронизировать клеточную популяцию.) Это отражается на скорости синтеза белка, которая падает практически до пуля.

В течение нескольких минут завершают деления ядра, делятся клетки и снова появляются полисомы, но теперь уже используются вйовь сентезированные мРНК. Прежпяя программа цикла выполнена, вступает в силу новая.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Novikoff A., Holtzman Е., Cells and Organelles, New York, Holt, Rinehart and Winston, Inc., 1970.

Ryter A., Jacob F., Annales Institut Pasteur, 107, 384 (1964).

Gall J. G., J. Biophys. and Biochem. Cytology, 5, 295 (1959).

Howard A., Pelc G.f Experimental Cell Research, 2, 178 (1951).

Guirard В. M., Snell E. E., in: I. C. Gunsalus and R. Y. Stanier, eds., The Bacteria, Vol. IV, New York, Academic Press, 1962.

Symposium on the Cell Division Cycle, Federation Proceedings, Vol. 28 (1969). 1 Этот способ центрифугирования подробно описан в гя. 14.

Halvorson Я. O.) Carter B. L. A., Tauro P., in: A. H. Rose and J. F. Wilkinson, eds., Advances in Microbial Physiology III, New York, Academic Press, 1971.

Scharff M. D., Robbins E., Science, 151, 992 (1966).

Глава 6

РОСТ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЖИВОТНЫХ, РАСТЕНИЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ

Как растет клеточная популяция и каковы внутренние и внеш-. ние факторы, контролирующие и ограничивающие рост, — вот чрезвычайно существенные биологические проблемы. Объектами исследования служат многие клеточные популяции. Используют диспергированные. культуры одиночных микроорганизмов, таких, как бактерии, дрожжи, амебы и др. Можно также удалить ткань у животного или растения, разделить ее на клетки и выращивать суспензию клеток так же, как и микроорганизмы, или выделить целую ткань и даже отдельный орган и выращивать их in vitro. Наконец, можно выращивать целые растительные и животные организмы, регулируя температуру, свет, влажность, снабжение питательными веществами и т. д.

Измерение роста и определение выживаемости Ллеток

Рост можно описать как увеличение числа клеток и измерить, подсчитывая число клеток в популяции или в ее части. Можно рассматривать рост как увеличение общего содержания протоплазмы и определять увеличение массы или объема клеток или таких компонентов, как белок, ДНК или азот. Если длительное время измерять число клеток в популяции и содержание протоплазмы в ней, то эти параметры будут увеличиваться параллельно; если же измерения проводить на коротком отрезке времени, то такого совпадения может и не быть. Так, на каком-то отрезке времени деления клеток могут происходить без увеличения содержания цитоплазмы, в результате чего возникнет большее число более мелких клеток. Напротив, образование цитоплазмы может происходить в отсутствие клеточных делений, в результате клетки становятся более крупными, но их число не меняется. Однако в конце концов клеточные деления без увеличения цитоплазмы прекратятся и наоборот.

При определенных условиях, например после того или иного экспериментального воздействия, бывает важно знать, сколько в популяции осталось жизнеспособных клеток. Если клетка может расти и делиться (может давать потомство), значит, она жизнеспособна. Если нет, то она погибла. Для определения жизнеспособности бактериальных клеток анализируемые образцы клеточной популяции высевают па твердые среды, например агаровые гели, содержащие все питательные вещества, необходи