мые для роста этих организмов. Поскольку клетки не могут двигаться по поверхности, потомки каждой жизнеспособной клетки будут оставаться на том же месте, образуя компактную массу клеток, которая называется колонией или клоном. Долю жизнеспособных клеток в популяции можно определить, подсчитывая число колоний, которые появляются па поверхности агара после высева па него известного числа клеток и инкубации в течение определенного периода времени.

Методы выращивания бактерий и других одиночных микроорганизмов

Обычно популяции клеток культивируют в жидкой среде. Питательный бульон готовят, растворяя необходимые питательные вещества в воде, доводят рН среды до нужного значения, и стерилизуют среду в автоклаве'паром высокого давления. В зависимости от объемов используемой среды применяют самые различные емкости — от пробирок с ватными пробками до колб, бутылей разного размера и громадных чанов на десятки тысяч литров (используемых в пивоварении и фармакологической промышленности). В питательную среду вносят небольшое число клеток и инкубируют при постоянной температуре. Если для организмов необходим кислород (а он необходим почти всегда),* то культуру инкубируют на механической качалке или через нее пропускают стерильный воздух. Клетки выращивают также на поверхности агара изолированными колониями или, если они посеяны достаточно густо, единым слоем.

Методы выращивания клеток животных и растений в культуре

В литературе эти методы ошибочно называют «культурой ткани». Это название отражает только тот факт, что для культивирования берут клетки из ткани. Обычно небольшой кусочек ткани животного разделяют на клетки, используя мягкую обработку про-теолитическим ферментом трипсином и обработку хелатами. Трипсин разрушает белковые связи между клетками, а хелаты связывают кальций и магний, которые способствуют слипанию клеток. Затем клетки помещают в питательную среду. После некоторого периода роста удаляют образовавшиеся скопления клеток, оставляя суспензию одиночных клеток. Их переносят в свежую среду. Проведя серию таких пассажей, или субкультур, можно получить стабильную линию животных клеток, которые постоянно растут в виде суспензии одиночных клеток1. Такг в лабораториях, где занимаются культурой клеток, можно найти культуры клеток HeLa человека, L-клеток мыши, фиброблас-тов кур, клеток гепатомы человека и т. д.

На поверхности агара клетки животных растут не очень хорошо. Для получения колоний небольшое число клеток высевают в питательную среду, налитую в чашку Петри. Клетки оседают на дно и прилипают к стеклу. Там, где они прилипают, образуются колонии. Через определенные интервалы времени старую среду осторожно сливают, не тревожа клетки, и добавляют свежую.

Диспергирование и культивирование клеток растений принципиально не отличаются от соответствующих приемов, используемых для клеток животных. Отличия касаются способов дезагрегации тканей и состава питательных сред. В настоящее время культивируют целый ряд различных клеток растений моркови, табака, ананаса и т. д.

S-образная кривая роста

На рис. 6-1 приведепы кривые роста, которые, как можно видеть, имеют S-образную форму. На абсциссе отложено время — в мипутах, днях, часах, годах, в зависимости от изучаемых организмов. На ординате отложен роет, который можно выразить числом клеток в бактериальной культуре^ числом живых существ на земле, размером или весом сеянца подсолнечника или крысы, размером или весом сердца или мозга. Другими словами, на ординате откладывается рост клеточной популяции, или отдельного многоклеточного организма, или любой его части, или популяции многоклеточных организмов. Если рост происходит в оптимальных условиях, то кривая роста во всех случаях будет S-образной. При анализе этой кривой возникает несколько вопросов: почему начинается рост, почему он прекращается, почему кривая роста имеет S-образную форму?

Обсуждая факторы, влияющие на рост, мы используем данные, полученные на наиболее простом объекте — культуре. Однако выводы, сделанные па основании этих исследований, справедливы для всех организмов, в том числе для растений и животных.

Представим себе, что мы поместили несколько сотен бактериальных клеток в закрытую ватной пробкой колбу со стерильной питательной средой. Затем приблизительно с часовым интервалом будем отбирать по 1 см3 питательной среды и подсчитывать в пробе число живых бактериальных клеток. На рис. 6-1, В показана кривая, которая получилась при этом.

1 Часто начинают работать с определенными линиями опухолевых клеток, у которых пе обнаруживается -тенденция к слипанию друг с другом.

Кривая состоит из трех частей: I — период, пазываемый лагфазой, в течение которого идут подготовительные процессы, II — период истинного роста, называемый экспоненциальной или логарифмической фазой, III — период, в течение которого рост прекращается и популяция вступает в стационарную фазу. Продолжительность ни одной из этих фаз не остается постоянной, она зависит от видовых особенностей бактерий и от условий, при которых они растут.

Лаг-фаза. Лаг-фаза — это период роста цитоплазмы и подготовки клетки к делению. Таким образом, это отрезок времени, в течение которого клетки становятся крупнее, но число их остается постоянным.

Почему клетки должны готовиться к делению? Почему они не могут сразу же вступить в экспоненциальную фазу роста? Дело в том; что клетка в экспоненциальной фазе роста несколько папоминает конвейер. Отдельные детали создаются последовательными операциями на самом конвейере, или их получают па основании контактов извне, по в конце концов все их соедипяют и получают готовый продукт. Важнейшим условием эффективной работы конвейера является согласованность всех операций. Детали должны поступать в нужное место, в нужное время и в пужпых количествах, все операции па конвейере должны происходить с одинаковой скоростью. Значит, если начать культивировать клетки, которые уже находятся в фазе экспоненциального роста (конвейер уже существует и функционирует), и обеспечить их необходимыми питательными веществами, то лаг-фазы не должно быть. Как раз такой результат и получается в действительности. И наоборот, если начать культивировать клетки не в фазе экспоненциального роста, то им нужно время, чтобы подготовиться к росту.

Теперь вернемся к подготовке клеток к фазе экспоненциального роста.

Ресинтез ферментных систем, необходимых для роста. Клетка, которая уже прошла фазу экспоненциального роста, в дальнейшем сталкивается уже не с проблемами роста, а с проблемами выживания. Она должна защищаться от продуктов выделения и других токсических соединений, которые могут образоваться в окружающей среде, и сохранить оставшиеся питательные вещества и энергию. Поступая так, клетка может потерять отдельные ферменты, которые ей больше не нужны и синтезировать, другие, необходимые для выживания. Если такие клетки перенести в свежую питательную среду, в которой опять возможен рост, а выживание перестанет быть проблемой, то все процессы должны развиваться в обратной последовательности. Но это изменение связано со значительной перестройкой цитоплазмы и с дополнительным синтезом ферментов и других макромолекул. Все это требует времени, отсюда необходимость лаг-фазы.

Л. Рост населения земного шара. Б. Рост цыпленка в эмбриогенезе и после вылупления (стрелкой указан момент вылупления). В. Рост популяции бактерий, высеянных в свежую питательную среду. 1 — с определенным интервалом брали пробы для определения числа бактерий в 1 см3 среды. На кривой хорошо видны три фазы. / — лаг-фаза, 11 — логарифмическая фаза, III — стационарная фаза, 2 — бактерии на стационарной фазе роста перенесли в другой флакон на свежую питательную среду. Кривая роста 2

повторяет 1.

Синтез или ассимиляция исходных продуктов. Каждая клетка должна запастись строительными блоками (аминокислотами, са-харами, жирными кислотами, витаминами и т.д.), необходимыми для того, чтобы создать столько цитоплазмы, чтобы ее хватило на две клетки. Если приток питательных веществ достаточен и эти соединения уже присутствуют в окружающей среде, то работа клетки несложная и соответственно лаг-фаза короткая. Если питательных веществ мало, то недостающие блоки нужно синтезировать из более простых веществ, находящихся в окружающей среде. Более того, эти блоки могут диффундировать из клеток. Следовательно, клетки .должны работать против градиента диффузии, накапливая их пороговые концентрации. В этом случае работа клетки будет более трудной, чем ее работа в богатой питательной среде, и соответственно лаг-фаза будет более длинной. Продолжительность лаг-фазы может также зависеть от числа присутствующих клеток, поскольку каждая клетка представляет собой небольшую фабрику для создания строительных блоков, и, чем больше таких фабрик, тем быстрее будут синтезироваться блоки и тем короче будет подготовительный период. Бактериологи говорят, что клетка, попав в среду, делает ее кондиционированной. Более того, подобно хорошо функционирующему конвейеру, каждая клетка, которая накопила достаточно блоков для образования двух новых клеток, обеспечивает также непрерывность притока веществ, так чтобы в свою очередь возникшие две клетки могли без задержки собрать или синтезировать достаточно блоков для образования четырех клеток й т. д. Таким образом, никакой задержки в дальнейшем не предвидится и рост может происходить быстро. Эти взаимосвязи отражены на рис. 6-2.

Экспоненциальная фаза. Теперь мы переходим к стадии активного роста и размножения и к S-образной кривой. Для того чтобы попять эту стадию, необходимо просто рассмотреть свойства популяций, которые активно растут при оптимальных условиях.

1. Чем больше организмов вначале, тем больше их мотет быть потом. Другими словами, потомки должны иметь родителей, и, чем больше родителей, чем многочисленнее потомство.

2. Почти все организмы в этой популяции размножаются в течение жизненного цикла. Бесплодны очень немногие, если такие вообще есть.

3. Генерационное время постоянно. Это означает, что для каждого организма время появлени