вия, касающиеся любой биологической структуры: 1) поскольку информация о будущей структуре заключена в самих субъединицах, то соответствующие субъединицы в оптимальных условиях температуры, рН и т. д. должны образовать определенную структуру или часть

Рис. 12-7. Структура фага Т4.

На схеме показано строение фага с растянутым (I) и сокращенным (II) хвостовым чехлом. Сокращение хвостового чехла происходит после прикрепления фага к поверхности бактериальной клетки и обеспечивает проникновение в нее ДНК фага. 1 — хвост, 2 — головка, 3 — воротничок, 4 — чехол, 5 —? нити, б — базальная пластинка, 7 — зубец, S — стержень хвостового отростка.

ее; 2) мутации, затрагивающие любую белковую субъединицу, должны изменить форму всей структуры. Эти выводы нашли прекрасное подтверждение при изучении становления формы у фага Т4 (рис. 12-7).

Были выделены мутантные линии фагов, которые инфицировали и убивали Е. coli и нормально развивались до определенной стадии, но не образовывали зрелых фагов. Электропные микрофотографии инфицированных бактерий подтвердили нарушение

Хоост Лилова

... Хвостовые нити

5,6,7,8,10,25,26 27,28,29,48,51,53

20,21,22 23,24,31

37,38

структуры фагов. Как поддержать жизнь этих мутантов? Были ис-пользовапы температурочувствительные мутанты, которые нормально растут в Е, coli и продуцируют зрелые фаги при 37°С, но пе при 43°С, в отличие от фага дикого типа, который может нормально развиваться при обеих температурах. Причина: мутация приводит к изменению белковой субъединицы, которая сохраняет свойственную ей форму при 37°С, по не при 43°С, поэтому при 37°С строепие фага не мепяется, а при 43°С — нарушается. Были выделены и другие мутанты (так называемые амбер-мутапты), которые пормальпо развиваются в одной липии Е. coli и не развиваются в другой. Между многими такими мутантами провели скрещивания. Оказалось, что мутации локализованы более чем в 60 различных генах. Каждый из них, видимо, ответствен за синтез специфического белка, а вместе они обеспечивают создапие трех основных компонентов фага: головки *, хвоста и хвостовых нитей. Так, при 43°С у мутанта 15 образуются нормальные головки и хвостовые нити, но дефектные хвосты, и они не могут соединиться вместе. У мутанта 14 образуются нормальные хвосты и хвостовые нити, но дефектные головки, и поэтому у пего не идет сборка. Но если экстракты, полученные из инфицированпых бактерий и содержащие дефектные части смешивали и инкубировали вместе, то из нормальных головок мутанта 15, нормальных хвостов мутанта 14 и нормальных хвостовых нитей обоих мутантов возникали зрелые фаги, способные инфицировать бактерии.' Сходным образом готовили препараты разрушенных клеток бактерий, инфицированных при 43°С бесхвостым мутантом 3, и бактерий, инфицированных при той же температуре бесхвостым мутаптом 18. В этих условиях образовывались нормальные хвосты и появлялись нормальные зрелые фаги. При инкубации порознь фаги оставались дефектпыми. Так, были детально расшифрованы все этапы морфогенеза, показанные на рис. 12-8. В настоящее время белковые субъединицы фага Т4 очищены и идентифицированы, и пет сомнения, что процесс сборки будет в конце концов выяснен во всех деталях на молекулярном уровне.

Развитие зародыша в пространстве и во времени. Программа для любителей вычислительных машин

1 Перед образованием головки ДНК фага свертывается спиралью вокруг белкового стержня. Затем происходит сборка белковых субъединиц оболочки и образуется шестигранная структура, изображенная на рис. 12-7.

Для того чтобы понять, как возникает форма фага, необходимо было разделить и охарактеризовать генетически и биохимически относительно ограниченное число компонентов и субъедипиц, проанализировать порядок их сборки и там, где это возможно, воспроизвести сборку in vitro в определенных экспериментальных условиях. Таким образом, можно сказать, что морфогенез фага описан в четырех измерениях — в трех пространственных и вре-менпбм. Уже сейчас, а в особенности, когда эта работа будет завершена, легко представить себе, какую громадную работу нужно будет проделать, чтобы описать в четырех измерениях морфогенез простейшего многоклеточного организма.

Как уже упоминалось в гл. 10, в прошлом исследователи проводили продолжительные наблюдения за развивающимися зародышами в обычном световом микроскопе. Они зарисовывали зародыши, фотографировали их или проводили цейтраферпую съемку и выясняли происхождение клеток и их перемещения. Иногда клетки метили красками или небольшими частичками угля, нанесенными на поверхность зародыша. Такие исследования могут в лучшем случае давать только частичные и поверхностные сведения о движениях клеток и их перегруппировках, причем только об очень пебольшом числе клеток.

В последние годы, однако, возникают новые методы изучения изменений зародыша в четырех измерениях. Используются два основных инструмента — электронный микроскоп и ЭВМ. Предположим, что мы хотим изучить одпу из 251 нервной клетки нематоды Oxyuris egui. Как уже упоминалось в гл. 9, у нематод эти клетки всегда занимают одно и то же место. Итак, мы выбрали для изучения моторную нервпую клетку № 36. Нужно охарактеризовать положение в зародыше не только самой клетки, но и аксона и всех дополнительных волокон и проследить, где эти волокна прикрепляются к другим нервным и мышечным клеткам. Кроме того, мы хотим рассмотреть все изменения этой клетки во времени: с момента возникновения до зрелого состояния. Мы начинаем с того, что заключаем взрослое животное в эпоксидную смолу и делаем очень тонкие продольные срезы. Срезы должны быть достаточно тонкие, чтобы рассмотреть их в электронном микроскопе. Отмечаем срезы, на которых находятся нервная клетка № 36 и все отходящие от нее волокна. Затем просматриваем всю серию, срез за срезом, как показано на рис. 12-9, и составляем программу для ЭВМ, чтобы реконструировать, как это делал Уолт Дисней, пространственную структуру нервной клетки и ее связей. Далее мы просим ЭВМ сохранить полученные данные в узле памяти и показать нам их на телевизионном экране, когда это понадобится. Затем, используя все более молодых животных, а потом и зародышей, мы повторяем весь процесс исследования. В конце концов ЭВМ дает нам последовательность изменений во времени формы клетки № 36 и ее положения в зародыше с момента, когда она впервые появляется в результате деления материнской клетки. В принципе мы можем проделать то же самое с остальными 250 нервными клетками и вообще со всеми клетками взрослого оргаСхематическое изображение каждого среза

К вычислительной машине

Рис. 12-9. Реконструкция положения клеток в пространстве.

Объяснения см. в тексте.

низма — проследить их изменения в обратном порядке, вплоть до момента возникновения, до клеток, из которых они образовались, до момента их возникновения и так далее, пока не дойдем до самого начала — оплодотворенного яйца.

Проделав все это, мы заложили бы в узел памяти ЭВМ самую замечательную мультипликацию. Результатом этой работы было бы полное топологическое описание эмбриогенеза Oxyuris equi, выяснение происхождения каждой клетки зародыша и изменений ее формы и положения во время развития. Мы могли бы затем вернуться к любой стадии, например к стадии гаструляции, и выяснить в деталях, между какими клетками зародыша устанавливаются контакты, проследить движение всех клеток в течение этого периода. Используя метод, представленный на рис. 12-9, мы должны были бы проделать гигантскую работу (хотя и возможную) даже для такого небольшого животного, как нематода. Если процесс будет автоматизирован, он останется таким же скучным, но не столь трудным. Тогда его можно будет использовать и для изучения формообразования у более сложноорганизованных зародышей.

Такой метод исследования морфогенеза еще только начинают использовать, причем пока лишь в нескольких лабораториях. Пионерские работы выполнены на нематодах и коловратках.

Смерть клеток в процессе морфогенеза животных

Мы уже рассмотрели два примера дифференцированных клеток, смерть которых запрограммирована и является результатом их специализации: 1) клетки стебелька и базального диска миксо-мицетов, которые погружаются в целлюлозный матрикс, сильно вакуолизируются и теряют ядро (оно дегенерирует); 2) ретикуло-циты, в ходе развития которых ядра выталкиваются. В определенном смысле можно сказать, что все компоненты любого многоклеточного организма, за исключением половых клеток (споры, гаметы и т. д.), которые дают начало следующей генерации, погибают в результате специализации. Однако в зародышевом разви-витии животных запрограммированная смерть клеток также играет специфическую морфогенетическую роль — при формировании конечпости, гонад и наружных. половых органов, в метаморфозе амфибий (резорбция хвоста головастика) и во многих других подобных процессах. Например, как уже упоминалось ранее, конечность цыпленка возникает в виде маленького бугорка. Небольшая группа эпидермальных клеток, расположенных на нижней стороне зачатка, на определенной стадии развития конечности внезапно погибает и дезинтегрируется. Это создает зону гибкости, в результате конечность сгибается и приближается к туловищу. Это первый этап формирования плеча. Другие группы клеток отмирают

на более поздних стадиях, и в результате образуются предплечье, локоть и пальцы. Если эти группы клеток пересадить в другие участки эпидермиса задолго до момента предопределенной гибели, они не погибнут. Энидермальпые клетки, которые займут их место, умрут вместо них. Но если они пересажены незадолго до рокового момента, то погибнут в предназначенный срок даже на новом месте.

Что является причиной смерти и каким образом она запрограммирована, пока еще неизвестно. Дезинтеграция мертвых клеток, вероятно, происходит под влиянием освобождающихся про-теолитических ферментов, в норме заключенных в небольшие пузырьки (лизосомы). Отходы удаляются блуждающими фагоцитами.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Caspar D., Huxley 1L, Klug A., in: The Giba Foundation Symposium on Principles of Biomolecular Organizati