сь открывает огромные возможности, особенно если применять его вместе с методом, описанным в следующем разделе.

Целые растения из одиночных клеток

Выращивали суспензию зрелых дифференцированных клеток корней, стеблей или листьев моркови и табака. Затем по одной клетке переносили в свежую жидкую среду. Возникали клоны: из клеток табака — аморфные каллусоподобные массы клеток, из клеток моркови — небольшие сердцевидные скопления, очень похожие на нормальные зародыши моркови. Затем эти клоны переносили па твердый субстрат — почву или агар, обогащенный минеральными веществами и гормонами роста растений, и выращивали. В конце концов из них развивались лормальные растения с корнями, стеблями, листьями и даже цветами и семенами (рис. 13-3). Следовательно, в ходе дифференцировки клеток, послуживших родоначальниками клонов, весь геном сохранялся.

Наследование способности к дифференцировке

В гл. 2 мы ввели представление о стволовых клетках. Существование стволовых клеток у зародыша указывает на то, что способность к дифференцировке в данном направлении (например, к дифференцировке в эригроцит) наследуется клетками на протяжении многих поколении. Обратите внимание на то, что не

Б

Рис. 13-4. Получение аллофенных мышей слиянием дробящихся

яиц.

А. Развитие in vitro мозаичных зародышей. Б. Пересадка их «приемной матери» (самке, спаренной с вазэктомированным самцом).

эритроцит производит эритроциты, а потомки клеток, ничем не похожих па эритроциты, неизменно дифференцируются в эритроциты. В следующем разделе мы детально рассмотрим это явление. Механизм наследования способности к дифференцировке представляет собой одну из самых интригующих и важных тайн биологии развития.

Клоны в зародыше, или как синтезировать мышь. На рис. 13-4 показана схема виртуозного эксперимента, требующего терпенияи умения делать руками тонкие вещи. Есть две ипбредные линии мышей: одна — с чисто черной шерстью, другая — с чисто белой. У черной самки вскоре после ее спаривания с черным самцом хирургически извлекали зародышей, находящихся па ранних стадиях дробления (2—8 бластомеров), и дезагрегировали их на клетки мягкой обработкой протеолитическим ферментом. То же самое проделывали с зародышами, полученными от скрещивания белых самок и самцов. Затем клетки зародышей мышей белой и черной линий, находящиеся на одной и той же стадии дробления, смешивали в небольшой капле жидкости. (Все это делалось в стерильной камере под микроскопом.) Клетки реагрегировали и объединялись случайным образом. Каждый такой смешанный агрегат клеток развивался в камере до стадии бластоцисты, затем его имплантировали в матку специально подготовленной самки. К этому моменту ее спаривали со стерильным (вазэктомирован-ным) самцом, поэтому ее эндокринная система и матка были подготовлены к восприятию зародыша, а собственных зародышей, которые могли бы усложнить опыт, не было. Рождение происходило в обычные сроки, и новорожденные мыши были нормального размера. У этих, так называемых аллофенпых мышей изучали окраску шкурок . Как и следовало ожидать, шкурки состояли из черных и белых участков, однако их распределение было совершенно неожиданным. От головы до хвоста обнаружили 34 зоны окраски — 17 пар, причем каждая пара зон была разделена по средней линии. Каждая зона была либо белой, либо черной, смешение цветов происходило только по краям зоп. Однако сами белые и черные зоны распределялись случайным образом, что и приводило к образованию полосатых мышей, мышей с шахматной окраской и т. д. Вот едипствеппое разумное объяснение, наблюдаемых явлений: на ранней стадии зародышевого развития 34 эпидермаль-ные стволовые клетки распределяются на определенном расстоянии друг от друга; эти клетки дают начало клонам меланоцитов (пигментные клетки), которые не мигрируют, а остаются в местах образования. В результате возникает столь необычная пигментация. Итак, можно заключить, что в норме у мышей пигментпые клетки образуются из 34 стволовых клеток. В пастоящее время проводятся сходные опыты с целью выявления стволовых клеток в нервной, мышечной и других тканях.

Еще о клонах у зародыша: мозаицизм по Х-хромосоме у самок млекопитающих. У половозрелых самок млекопитающих, в том числе и у человека, неделящиеся клетки характеризуются некоторыми особенностями конденсации хроматина. Из двух Х-хромосом одна всегда находится в конденсированном состоянии в виде небольшого интенсивно окрашивающегося тельца, а другая полностью деспирализована, как и все другие хромосомы. Вводя предшественник РНК (3Н-уридин) и исследуя автографы, можно показать, что все деспирализоваппые хромосомы синтезируют РНК, а конденсированная Х-хромосома пе синтезирует. В клетках взрослых самцов никогда пе образуется интенсивно окрашенного тельца. Единственная Х-хромосома всегда полностью деспирализована и синтезирует РИК.

Следует подчеркнуть, что конденсированная Х-хромосома не дегенерирует, она только не участвует в процессе транскрипции. Во время митоза она деспирализуется и реплицируется, как все другие хромосомы. Копии ее переходят в дочерние клетки. Эти копии быстро конденсируются и пе участвуют в процессе транскрипции и в дочерних клетках.

В только что оплодотворенном яйце млекопитающего или в клетках зародыша на ранних стадиях дробления обе Х-хром'осомы деспирализованы. Конденсация происходит позднее, однако насколько позднее, пока неясно. Какая из Х-хромосом в клетке будет в конденсированном состоянии — дело случая. Однако если однажды с ней это произошло, то в образующемся клоне клеток в конденсированном состоянии окажутся именно она и все ее «потомки».

Недавно по этому вопросу получены новые данные, причем весьма остроумным способом. Удалось показать, что все эритроциты женщины являются потомками приблизительно восьми стволовых клеток. Сделано это следующим образом.

Среди народов, населяющих Средиземноморье, встречается генетическое заболевание, называемое латиризмом. Для него характерна аллергическая реакция на конские бобы. В процессе развития аллергической реакции возникает тяжелая гемолитическая анемия (лизируется множество эритроцитов). Было показано, что эта болезнь связана с мутацией одного гена, приводящей к образованию дефектного фермента. Фермент глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназа (Г-6-ФДГ) катализирует следующую реакцию: н

не—ОРО3Н2 не—ОРО3Н2

~ги

Этот фермент присутствует в клетках всех тканей, в том числе и в эритроцитах. Ген Г-6-ФДГ локализован в Х-хромосоме. Таким образом, самец, имеющий только одну Х-хромосому, можетиметь генотип либо Г+ (дикий тип), либо Г-, и тогда фермент дефектен. Самка может иметь генотип Г+ Г+ Г~ Г" или Г+ Г~. Для эритроцитов гетерозиготного организма характерен средний уровень активности Г-6-ФДГ: он ниже, чем у Г+ самца, но гораздо выше, чем у Г~ самца. Это объясняется тем, что в крови (Г+ Г~) -особей имеется -смесь эритроцитов, причем одни содержат только нормальную Г-6-ФДГ, а другие только дефектный фермент. У первых конденсирована Х-хромосома, несущая ген Г~, у вторых — хромосома, несущая геп Г+.

Было выбрано 950 женщин с острова Сардинии. На основании определения активности Г-6-ФДГ в крови их отцов и сыновей удалось показать, что эти женщины гетерозиготны (Г+ Г-) . Несмотря на такой генотип (Г+Г~), четыре из 950 имели только дефектные эритроциты (ни одной нормальной'клетки). Как это могло произойти?

В табл. 13-2 дана схема логических рассуждений. Представим себе, что все эритроциты происходят из единственной стволовой клетки, у которой одна из Х-хромосом уже конденсирована. Какова при этих условиях вероятность того, что у гетерозиготного организма будет конденсирована хромосома, несущая ген Г+ (следовательно, будут образовываться только дефектные эритроциты)? Ответ: 1/2. Л если стволовых клеток две? Какова вероятность того, что обе клетки дадут дефектных потомков. Ответ: (1/2)?= 1/4. Реально существующая величина — 4/950, или около 0,4%. Как видно из табл. 13-2, это соответствует приблизительно 8 стволовым клеткам. Однако вы можете возразить: а что, если Х-хромосома конденсируется на стадии 8 бластомеров? Не получится ли при этом тот же результат независимо от того, сколько существует стволовых клеток? Конечно, получится. Однако если бы это было так, то у гетерозиготных женщин, имеющих только дефектные эритроциты, все другие клетки тоже содержали бы только дефектный фермент, а у этих 4 женщин в других тканях (коже, жировой ткани и т. д.) было достаточно много нормального фермента. Из этого следует, что конденсация Х-хромосомы происходит значительно позже стадии 8 бластомеров.

Позвольте мпе на минуту задержаться и попытаться дать общую картину дифференцировки клеток у млекопитающих па основании результатов этого опыта и опытов с аллофенными мышами. Можно представить себе, что во время дробления или позднее небольшие группы клеток подвергаются действию специфических стимулов, природа которых зависит от локализации клеток и стадии развития. Стимул вызывает определенные изменения кле

брюшную полость личинки, другой — в брюшную полость молодой взрослой особи. В первом случае пересаженный диск получает гормональные сигналы, запускающие метаморфоз насекомого-реципиента, и дифференцируется одновременно с его тканями. Во втором случае гормональные сигналы отсутствуют и пересаженный диск просто дорастает до дефинитивного размера (в течение нескольких недель). Этот вторично возникший диск можно опять разделить на кусочки. Один из них можно вновь заставить расти, а другой использовать для того, чтобы проверить/ сохранилась ли его способность к дифференцировке. Таким образом можно выяснить, меняется ли эта способность на протяжении многих поколений клеток.

После одного нассажа во взрослый организм клетки имаги-нального диска полностью сохраняют способность к специфической дифференцировке. Так, антеннальные диски образуют нормальные антенны, диск крыла — нормальное крыло. Однако после нескольких пересадок потенции диска обычно изменяются. Способность к дифференцировке либо полностью исчезает, то есть диск, реимнлантированпый в личинку, остаетс