рагменты до 100°, и они разделяются на 22000 однонепочечных фрагментов, причем все они, согласно нашему предположению, должны быть разными. Теперь мы медленно охлаждаем их. Они сталкиваются случайным образом, и, если встречаются комплементарные цепи, происходит восстановление двухцепочечной спирали. Поскольку каждый фрагмент представлен единственной копией, то шансы на встречу с комплементарным партнером у всех одинаковы и процесс реассоциации должен происходить (и в действительности происходит) плавно и равномерно (рис. 15-1, слева).

Проведем теперь тот же самый эксперимент с ДНК коровы. Ее геном (3-109 пар нуклеотидов) превратится в 7 500 000 двухце-почечных фрагментов ДНК, а после нагревания — в 15 000 000 од-ноцепочечных. Если каждый фрагмент представлен единственной копией, то кривая реассоциации должна быть похожа на кривую, которая получается в опыте с фрагментами ДНК Е. coli. Но это не так (рис. 15-1, справа). Значит, некоторые фрагменты присутствуют во многих копиях. Их комплементарные цепи встречаются очень часто, и ренатурация идет очень быстро. Другие фрагменты представлены меньшим числом копий, их реассоциация идет медленнее, чем в первой группе, но все еще достаточно быстро. Эти повторяющиеся фрагменты составляют приблизительно 40% всей ДНК коровы! Оставшиеся 60% фрагментов, вероятно, уникальны, и их реассоциация идет со скоростью, сравнимой со скоростью реассоциации фрагментов ДНК Е. colu

Из представленных выше данных следует, что у коровы приблизительно 3 000 000 генов, причем около 1800 000 из них имеют уникальную последовательность нуклеотидов. Остальные (1200 Q00) составляют группы повторяющихся генов. В каждой группе повторяющиеся гены имеют идентичную последовательность нуклеотидов, по крайней мере на протяжении нескольких сотен пар. Видимо, очень немногие гены имеют до 100000 копий (очень быстро ре ассоциирующиеся). Другие, ре ассоциирующиеся

1геном ?. coli содержит 4,5-Ю пар нуклеотидов

i геном коровы содержит 3-Ю9пар щкштидов

Контролируемое механическое разрушение

11000 двцхцепочечных 7500000 двуточечных

фрагментов, содержащих фрагментов, содержащих

по 400 пар нуклеотидов ™ 400 тР нуклеотидов

Нагревание до Ю0°С

22000 одноцепочечных фрагментов, и все разные

15000000 одноцепочечных фрагментов, орни фрагменты представлены одной копией, другие-многими

несколько медленнее, представлены, вероятно, 10 000, 1000 или меньшим числом копий, но, конечпо, значительно больше, чем одной копией.

Идентифицированы ли какие-нибудь повторяющиеся гены? Да. Во всех типах клеток у эукариотов имеется, по-видимому» не

сколько сотен копий каждого гена рибосомной РНК !. Многочисленные копии собраны на хромосомах в области ядрышкового организатора. Вероятно, существуют и многочисленные копии генов трапспортных РНК — всего приблизительно но 1000 копий каждого гена в группе.

Однако мы не знаем, для чего нужны многие другие повторяющиеся гены. Известно, что любая мутация в любом организме, вызывающая изменение определенного белка, связана, по-видимому, с изменением единственного гена. Это довод против того, что повторяющиеся гены кодируют белки. А что же они делают?

Выражение генов у миксомицетов

Количественный контроль как способ выражения генов в развитии миксомицетов, а возможно, и других организмов. Как упоминалось в гл. 8, когда амебы миксомицета образуют плодовое тело,

УТФ и

июкозо-1-фдсфат

4 /

УДФРпирофосфорилаза

Гликоген 2

уДФ-глюкозаУДФ-галактоза

?Целлюлоза

Трегалозо-6-сросфат

УДР-еалактоза: пошсашридгалактозид-трансфераза

I / {

Трегалоза Муктолисахарид

Рис. 15-2. Четыре фермента, притшающих участие в формировании плодового тела миксомицета.

1 ДНК Е. coli имеет 6 копий каждого из генов рРНК. Это, возможно, ее единствеппьге повторяющиеся гены, слишком небольшая фракция, чтобы ее можно было определить с помощью описанных выше опытов по реассоциации.

около 20% их сухого веса превращается в несколько полисахаридов и один дисахарид. На рис. 15-2 показана упрощенная схема синтеза этих веществ. Схема приводится, чтобы обратить внимание на четыре фермента. Далее они будут называться просто ни-рофосфорилаза (1), синтетаза (2), эпимераза (3), трансфераза (4).

Каждый из четырех ферментов синтезируется на определенной стадии образования плодового тела. На рис. 15-3 показана динамика их накопления и исчезновения. В какой мере геном контролирует эту динамику? Полностью. Так, в мутаптных линиях D. disco-ideum, которые не могут образовывать многоклеточные агрегаты, то есть не могут начать построение плодового тела, не накапливается ни одип из этих ферментов. Если у мута'нтов образование плодового тела блокируется на более поздних стадиях, то соответст0 4 8 16 20 24 28 -О

Часы

! Г

Рис. 15-3. Накоплепие и исчезновение четырех ферментов в процессе образования плодового тела. I — пирофосфорилаза, г — синтетаза, з — трансфераза, 4 — эпимераза.

вующий блок обнаруживается в накоплении или исчезновении ферментов. Мутанты, развитие которых сдвинуто во времени, характеризуются соответствующими сдвигами в накоплении и исчезновении ферментов.

Накоплению каждого фермента должен предшествовать период синтеза специфической РНК. С помощью ингибитора сиптеза РНК актипомицина D был определен период транскрипции для каждого вида РНК. Если ингибитор добавлять в начале периода транскрипции, то соответствующий фермент не образуется, если в конце — синтезируется нормальное количество фермента, а если в середине — то промежуточное количество, причем, чем позже добавляется актомицин, тем больше фермента синтезируется. На рис. 15-4 показаны периоды транскрипции и их отношение к периодам синтеза самих ферментов. Возникает ряд интересных вопросов.

1. Периоды транскрипции смещены во времени. Как РНК-по-лимераза знает, когда начать и когда кончить транскрипцию каждого гена?

О

?2ь

ю

15

1111

20

юз

25

Рис. 15-4. Периоды транскрипции {белые прямоугольники) и трансляции (черные прямоугольники).

1 — трегалозо-6-фосфат-синтетаза, 2 — УДФГ-пирофосфорилаза, 3 — УДФ-галактозополисахарид-трансфераза, 4 — УДФ-галактозо-4-эпимераза.

2. Продолжительность периодов между началом транскрипции и началом синтеза соответствующего белка колеблется от 1,5 до 5 ч. Почему? Почему мРНК не транслируется сразу же после ее синтеза? Нужен ли этот период для того, чтобы подготовить РНК к выходу из ядра (что бы под этим ни подразумевалось), или это — время, необходимое для транспорта РНК из ядра к месту синтеза фермента? Может быть, это время уходит на ассоциацию РНК с рибосомами или, наконец, РНК-полисомпый комплекс ждет какого-либо сигнала, чтобы начать синтезировать белок?

3. За короткий период транскрипции (перед добавлением акти-номицина) синтезируется небольшое количество соответствующего фермента; более длительный период транскрипции обеспечивает синтез большего его количества. Таким образом, мРНК для пиро

время агрегаты накапливали такое же количество пирофосфорила-зы, как и в первый раз. Затем образующиеся плодовые тела еще раз дезагрегировали и повторяли все манипуляции. Клетки вновь реагрегировали; агрегаты достигали соответствующей стадии развития и накапливали третью порцию пирофосфорилазы. Заслуживают внимания еще два факта: 1) если клетки дезагрегированных плодовых тел поместить на твердую поверхность, но на таком расстоянии, что они не смогут войти в контакт друг с другом и реаг-регировать, дополнительного синтеза пирофосфорилазы не происходит. Таким образом, контакт клеток является сигналом для начала дополнительного цикла накопления фермента; 2) если дезагрегированные клетки поместить на твердый субстрат так, что они смогут реагрегировать, но добавить актиномицин D, развитие возобновится, они дойдут до той же стадии, но дополнительного накопления фермента не произойдет. Таким образом, для каждого дополнительного цикла синтеза фермента необходим новый период транскрипции. Было показано, что так же осуществляется контроль синтеза всех четырех ферментов, описанных выше.

Эти результаты согласуются с предположением о том, что транскрипция определенного гена начинается только после того, как развитие плодового тела достигает определенной стадии; ген, однажды транскрибированный, может транскрибироваться снова, если заставить клетки повторить соответствующий этап морфогенеза. Но каждый раз, как возобновляется транскрипция гена, синтезируется определенное количество мРНК и накапливается новая порция белка. Каким образом информация о том, что достигнута определенная стадия морфогенеза, попадает в ядро и как она инициирует транскрипцию определенных генов? Что контролирует время транскрипции и трансляции, т. е. как обеспечивается синтез определенной порции белка?

Регуляция синтеза гемоглобина

Синтез гемоглобина в процессе развития ретикулоцитов: стабильные и нестабильные мРНК. У 7-дпевного зародыша мыши определенные клетки желточного мешка пачипают дифференцироваться в эритроциты. К 10-му дню они в виде незрелых эритро-бластов выходят в кровавое русло (гл. 11) и уже здесь превращаются в зрелые эритроциты. На 16-й день они исчезают. Эти клетки синтезируют эмбриональный гемоглобин.

Между 10-м и 11-м днем появляется вторая популяция эритро-бластов, на этот раз в печени. К 13-му дню они выходят в кровяное русло, где и происходит их созревание. Эти клетки синтезируют обычный, гемоглобин. Печень продолжает вырабатывать эри-троидные клетки до рождения (21-й день), после чего эту функцию берут на себя селезенка и костный мозг.

На 11-й день гемоглобин составляет только около трети всех белков, синтезированных в проэритробластах и ранних эритро-бластах. В процессе превращения этих клеток в зрелые эритро-бласты и затем в эритроциты утрачивается ядро, скорость синтеза гемоглобина остается постоянной, а синтез других белков надает до нуля. Ясно, что потеря ядра означает прекращение синтеза мРНК. Тем не менее синтез гемоглобина продолжается еще-в течение 48 ч. Следовательно, глобиновые мРНК должны сохраняться по крайней мере в течение этого период