а, а неглобиновые мРНК быстро расходоваться. Опыт с актиномицином D показывает, что это действительно так. На 11-й день беременности из кровяного русла зародыша выделили дифференцирующиеся клетки и инкубировали их в течение 1 ч в присутствии актиномицина D. Затем в среду на 10 мин добавили соответствующие радиоактивные предшественники (3Н-уридип или 14С-валин), чтобы определить скорость включения их в РНК и общий белок. Для определения скорости синтеза гемоглобина его отделяли от остальных белков. Результаты представлены в табл. 15-2.

Таблица 15-2

Относительная скорость .синтеза1

РНК Общий белок (включая гемоглобин) Только гемоглобин

без актиномицина с актнно-мицином без актиномицина с актиномицином без актиномицина с актиномицином

В начале опыта Через 1 ч

1 По скорости палии для белка) в 51 47

включения течение 10 оТ7

радиоакти] -минутной I 38 . 46

вных предн тнкубации. 22

1ественнико 15

14,4 в (уридин 14

для ГНК.

Сиптез РНК практически прекращался через несколько минут после начала инкубации. Скорость синтеза гемоглобина не изменялась, в то время как скорость синтеза общего белка снижалась более чем вдвое (и большую часть синтезирующегося белка составлял гемоглобин). Таким образом, продолжительность жизни неглобиновых мРНК чуть больше 1 ч.

Такая же разница в продолжительности жизни глобиновых и неглобиновых мРНК обнаружена в развивающихся эритроидных клетках, образующихся в печени зародыша.

Талассемия — генетический дефект контроля синтеза гемоглобина. Эта болезнь является результатом мутации одного гепа. У больных JB разной степени проявляется гемолитическая анемия.

В эритроидных клетках нормального взрослого организма синтезируется равное количество а- и fi-цепей, которые затем соединяются, образуя обычную молекулу глобина, имеющую структуру агрг. У больных талассемией синтезируется нормальное количество а-ценей и очень небольшое — fi-цепей. Эритроциты этих больных содержат гемоглобина меньше, чем обычно (отсюда и анемия) ; кроме того, в них обнаружены характерные гранулы, состоящие* из избыточных а-цепей.

Можно синтезировать гемоглобин in vitro, используя препараты разрушенных эритроцитов. Для этого нужно взять концентрированную смесь: 1) мРНК, выделенной из полисом эритроцитов; 2) рибосом; 3) факторов, присутствующих в цитоплазме (таких, как транспортные РНК и др.), и 4) всех 20 радиоактивных аминокислот. При инкубации этой смеси сначала восстанавливаются мРНК-нолисомные комплексы, а затем возобновляется синтез гемоглобина. Через определенное время гемоглобин и свободные а-и fj-цепи выделяют из смеси, чтобы определить, включились ли в них меченые аминокислоты. По выделенным препаратам можно судить о генотипе организма. Так, если берется смесь компонентов из эритроцитов нормального организма, то а- и fJ-цепи синтезируются в равных количествах; если же взяты эритроциты больных эритробластической анемией, то р-цепей синтезируется очень не-мпого или они совсем не образуются, тогда как синтез а-цепей идет нормально. Дефектной является только мРНК. Вот доказательства: Очищенная мРНК из эритроцитов здоровых людей + Рибосомы и другие компоненты от здоровых или от больных людей—Одинаковое количество а и (З-цепей; Очищенная мРНК из эритроцитов больных людей + Рибосомы и другие компоненты от здоровых или от больных людей = Нарушение синтеза Р-цепей.

Следовательно, в результате мутации образуется меньше мРНК для fi-цепей или эта мРНК становится менее стабильной. Ответ на этот вопрос может помочь в поисках средств лечения таких больпых, а также пролить некоторый свет на проблему дифференциальной активности генов.

Пуффы хромосом

Клетки некоторых тканей пасекомых содержат гигантские хромосомы. По числу и по форме они не отличаются от хромосом половой клетки, но по размеру значительно их превосходят. Объясняется это тем, что гигантские хромосомы состоят из большого пучка цепей ДНК. Считают, что,гигантские хромосомы образуются в результате повторяющихся циклов репликации ДНК по всей длине хромосомы. В обычных клетках за репликацией ДНК следует митоз, тогда как в некоторых тканях реплицированпые цепи остаются соединенными друг с другом, что и приводит к увеличению размера хромосомы. Великолепный пример, хорошо известный уже многим поколениям студентов-биологов, представляют гигантские хромосомы слюнных желез дрозофилы, однако сейчас такие хромосомы обнаружены и во многих других тканях (в средней и прямой кишке, мальпигиевых сосудах и т. д.).

Рис. 15-6. Четвертая хромосома из клеток слюнных желез Ckironomus tentans.

А. В неактивном состоянии. В. С двумя типичными пуффами. Обратите внимание, что можно выяснить, из какой полосы образовался тот

или иной пуфф (см. стрелки).

На рис. 15-6 показана гигантская хромосома из слюнной железы Ckironomus. Кольца обусловлены локальными различиями в структуре ДНК (изменения толщины в результате .локальной де-спирализации цепей и т. д.). Поскольку все цепи расположены так, что одинаковые участки в каждой из них находятся на одном уровне, эти различия становятся заметными; под микроскопом они выглядят, как кольца.

Почти все кольца четко очерчены, однако есть и диффузные кольца. Именно в этих участках хромосомы и образуются пуффы.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в пуффи-рующих участках цепи ДНК деспирализованы. Более того, в них, по-видимому, происходит активный синтез РНК.

Было показано, что синтезирующаяся в этих участках РНК выходит из ядра в цитоплазму и соединяется с рибосомами. Заманчиво предположить, что это мРНК и что впуффах она синтезируется активно.

Характер пуффинга гигантских хромосом отличается в разных -тканях и на разных стадиях.

1. Тканеспецифические пуффы. Если в любой момент жизни

насекомого сравнить гигантские хромосомы различных тканей, то

окажется, что характер пуффинга специфичен для каждой ткани.

Другими словами, на определенной стадии жизненного цикла насекомого в определенной хромосоме слюнной железы пуфф всегда

будет находиться в одном и том же участке, а в той же хромосоме клеток средней кишки на той же-стадии —в другом. Каждый

такой участок соответствует гену или небольшой группе генов

и может служить хорошей иллюстрацией того, что в любое время

в различных тканях особенно активны разные гены.

2. Стадиоспецифические пуффы. Если исследовать хромосомы

в одних и тех же тканях в различные периоды жизненного цикла

насекомого, можно обнаружить, что пуффы появляются и исчезают в различных участках хромосом весьма закономерно.

Синтез РНК на ранних стадиях зародышевого развития

Направленные изменения синтеза рРНК в процессе оогенеза и раннего зародышевого развития. Как было показано ранее, гены рибосомных РНК собраны вместе в области ядрышкового организатора. Исследование ДНК, выделенной из многочисленных ядрышек ооцитов, позволило выявить следующий порядок расположения генов:

28$ 18S Спейсерный 28S 18$ Спейсерный

ген ген участок ген ген участок

Пары генов 28S- и 18S-pPHK перемежаются участками приблизительно такого же размера. Функция их пока неизвестна. Поскольку они разделяют пары генов, им было дано название «спейсер-ные» участки.

РНК-полимераза инициирует транскрипцию с начала гена 28S и продолжает ее в спейсерном участке. В результате синтезируется гигантская молекула РНК. В некоторых случаях (например, в клетках человека) транскрипция не заканчивается, пока полиме-раза не доходит до конца спейсерного участка и не образуется молекула с константой седиментации 45S и молекулярным весом около 4 млн. У Xenopus РНК-полимераза проходит только около 10% спейсерного участка, и поэтому синтезируется молекула-предшественник меньшего размера. Потом гигантская цепь РНК расщепляется в определенных участках нуклеазами и образуются 28S- и 18S-pPHK. Часть РНК, транскрибированная со спейсерного участка, в конце концов полностью распадается на отдельные нуклеотиды. В последние годы усовершенствование методов приготовления препаратов и улучшение качества электронных микроскопов позволили получить микрофотографии, подобные представленной на рис. 15-7. РНК-полимеразы показаны на фотографии в тот момент, когда они осуществляют транскрипцию генов рРНК. Ряд молекул РНК-полимеразы движется вдоль цеци ДНК справа налево, причем все они стартовали с первой пары генов рРНК. Молекулы, находящиеся ближе к концу, уже почти закончили свою работу и несут длинные цепи РНК. Чем ближе к месту старта, тем соответственно короче синтезированные цепи.

Во время оогенеза единственное ядро ооцита благодаря многочисленным ядрышкам синтезирует рРНК с огромной скоростью (приблизительно в 200 000 раз быстрее, чем ядро клетки печени, например). В конце оогенеза синтез всех РНК прекращается. Сразу после оплодотворения синтез РНК возобновляется, но при этом рРНК совсем не синтезируется. Ядрышки исчезают. В это время синтезируется только мРНК, и так продолжается на протяжении всего периода дробления. В- начале гаструляции во всех клетках образуются новые ядрышки (но теперь уже только по два на каждое диплоидное ядро), возобновляется синтез транспортных РНК, а еще через 4 ч начинается синтез рРНК.

Приведенный ниже опыт свидетельствует о том, что какие-то компоненты яйца специфически подавляют синтез рРНК (и тРНК). Ядро клетки зародыша, завершившего гаструляцию, пересаживают в энуклеированную яйцеклетку Xenopus. На этой стадии клетки уже активно синтезируют все классы РНК. Через 40 мин после пересадки ядрышки исчезают и синтез рРНК и тРНК прекращается; синтез мРНК продолжается на том же уровне; синтез рРНК и тРНК, как и у интактных зародышей, возобновляется на стадии гаструлы.

Это четкий пример контроля на уровне транскрипции, поскольку регуляция осуществляется не на уровне белкового синтеза, а на уровне синтеза- РНК. Мы"0пять подошли к вопросу о том, как молекула полимеразы узнает, какой участок генома она может транскрибировать, а какой нет. Определяется ли это узнавание свойствами полимеразы, ДНК или чего-нибудь еще?

Молекулы полимеразы (точки в центре) дв