ижутся справа налево вдоль цепи ДНК. Синтезированная рРНК уже начинает соединяться с рибосомными белками.

Синтез бедка на ранних стадиях зародышевого развития

Характер синтеза белка у ранних зародышей морского ежа.

Неоплодотворенное яйцо морского ежа находится в «стационарном» состоянии. Синтез РНК не обнаруживается, а синтез белка идет на минимальном уровне. Однако через несколько минут после оплодотворения скорость синтеза белка возрастает приблизительно в 10—20 раз. Исходная низкая скорость синтеза белка не связапа с отсутствием мРНК или каких-пибудь других классов РНК. Обработанное актиномицином яйцо после оплодотворения может синтезировать белок с той же скоростью по крайней мере в течение нескольких часов. Низкая скорость синтеза белка объясняется, по-видимому, каким-то дефектом в белоксиптезирующем аппарате. Радиоактивные аминокислоты, добавлецные к гомоге-натам неоплодотворенных яиц морского ежа, почти не включаются в белок. Уровень включения в гомогенаты только что оплодотворенных яиц в 10—20 раз выше. Удалось установить, что низкий уровень синтеза белка в неоплодотворенных яйцах зависит от рибосом. Если взять рибосомы оплодотвореппого яйца и растворимые компоненты оплодотворенного или неоплодотворенного яйца, то будет идти интенсивный синтез, а рибосомы неоплодотворенного яйца не обеспечивают синтеза, что бы к ним не добавляли. Обработка неактивных рибосом в течение короткого промежутка времени протеолитическим ферментом — трипсином — в очень низкой концентрации приводит к их активации. Предполагают, что неактивные рибосомы каким-то образом маскированы, а после оплодотворения происходит их демаскирование.

Какие белки синтезируются во время дробления? Относительно немногие. На рис 15-8 показаны профили растворимых белков зародышей морского ежа на двух стадиях развития. Растворимые экстракты наносят на цилиндрическую колонку, содержащую мелкие частички химически модифицированной целлюлозы (ДЭАЭ-целлюлозы). Белки адсорбируются в верхней части колонки. После этого начинают медленно и осторожно добавлять сверху раствор, постепенно увеличивая концентрацию соли, и собирают фракции после прохождения раствора через колонку. При использовании раствора соли низкой концептрации практически все белки остаются связанными с целлюлозой. В растворе* соли высокой концентрации (около 1 М) связи разрушаются и все белки вымываются. (Принято говорить, что белки элюируют с колонки.) При промежуточных концентрациях одни белки вымываются, а другие нет, в зависимости от размера и электрического заряда. Это стандартный метод разделения белков.

Растворимые белки зародышей со стадии двух бластомеров и со стадии средней бластулы смешивали в равной пропорции. Первые инкубировали с момента оплодотворения с 14С-лейцином, а вторые — с 3Н-лейцином. С помощью радиоактивного счетчика можно отличить эти изотопы друг от друга. Профили белков, синтезированных на двух стадиях развития, значительно отличаются друг от друга и от профиля белков, уже имеющихся в зародыше на стадии 2 бластомеров. На самых ранних стадиях зародыши синтезируют, вероятно, относительно немногие виды белков.

Фракции

Рис. 15-8. Разделение растворимых белков, выделенных из зародышей морского ежа на двух стадиях развития.

Мы уже рассматривали одну часть программы белкового синтеза. К концу дробления на поверхности зародыша появляются реснички, с их помощью личинки после вылупления двигаются в воде. Реснички морского ежа имеют строение, типичное для ресничек и жгутиков всех эукариот, — девять периферических микротрубочек, окружающих две центральные трубочки. В их состав входит ограниченное число белковых субъединиц, в том числе тубулин, динеин и несколько минорных компонентов. Динеин сам состоит из двух различных субъединиц. Одна из них, вероятно, АТФаза другая — структурный компонент, прикрепляющий АТФазу к трубочке.

Когда синтезируются эти компоненты? На разных стадиях дробления зародыши на короткое время помещали в раствор ИСлейцина. Затем меченую аминокислоту удаляли, и зародыши развивались до стадии вылупления. У личинок выделяли реснички и разделяли их на субъединицы для того, чтобы определить, какие из них мечены и насколько интенсивно. Таким образом, можно получить представление о динамике синтеза белков. Были получены следующие результаты.

1. Синтез тубулина начинается вскоре после оплодотворения до первого деления-ядра и продолжается с постоянной скоростью в течение раннего развития.

2. Ферментная субъедипица дипеина нредсуществует в ооците и не синтезируются после оплодотворения. Структурная субъедипица на ранних стадиях зародышевого развития синтезируется с постоянной скоростью.

3. Некоторые минорные компоненты также синтезируются в этот период с постоянной скоростью. Однако часть из них начинает синтезироваться непосредственно перед сборкой ресничек. По-видимому, эти минорные субъединицы ответственны за размещение микротрубочек по схеме 9 + 2. Само образование ресничек также, вероятно, обусловлено появлением этих белков.

4. Синтез двух минорных компонентов, по-видимому, резко снижается перед началом образования ресничек. Возможно, они выполняют регуляторную функцию, определяя длину или число ресничек.

Следует отметить, что образование ресничек не сводится только к этим синтезам. До начала морфогенеза тубулин существует в неактивном состоянии и не способен полимеризоваться. Химическая природа его активации неизвестна. После образования реснички «дозревают». Микротрубочки и динеин в это время прочнее встают на свои места, и у поздней личинки растворить их труднее, чем у только что вылупившейся. Химия процесса «дозревания» неизвестна.

Процессинг мРНК

Гетерогенная ядерная РНК — еще одна загадка. Суспензию развивающихся эритробластов утки инкубировали в присутствии 3Н-уридина. Через определенные промежутки времени брали пробы клеток и определяли, какое количество предшественника включилось в РНК. Результаты представлены на рис. 15-9.

Можно видеть, что интенсивность включения метки сначала плавно возрастает, затем кривая быстро выходит на плато. Выход па плато означает, что клетки либо прекращают синтез РНК, либо синтезированная РНК нестабильна и разрушается с такой же скоростью, с какой синтезируется новая. Разумеется, верно второе предположение. Клетки не прекращают синтеза РНК в момент, когда кривая выходит на плато. Если сестринские клетки инкубировать в течение 7 ч и только затем добавить 3Н-уридин, предшественник будет очень активно включаться в РНК. На рис. 15-9 показано также, что почти вся синтезированная РНК нестабильна. Если клетки обработать актиномицином D, чтобы остановить дальнейший синтез РНК, то 80-90% ранее синтезированной РНК исчезает очень быстро и только 10—20% сохраняется.

800

Время, часы

Рис 15-9. Синтез и деградация РНК в эритробластах утки.

Стрелки, направленные вверх, указывают моменты внесения уридина; стрелка, направленная вниз,— момент внесения актиномицина Д.

Таким образом, эритробласты утки производят два вида РНК: стабильную и нестабильную. Как распределены эти РНК в клетке? Если клетки мягко разрушить, так чтобы ядра остались неповрежденными, можно увидеть, что практически вся нестабильная РНК находится в ядре, тогда как почти вся стабильная — в цитоплазме, где она связана с полисомами.

Различаются ли фракции ядерной и цитоплазматической РНК чем-нибудь еще, кроме стабильности? Существует очень точный метод классификации РНК по их размерам.

Распределение молекул РНК по размерам может быть получено при центрифугировании их в градиенте плотности сахарозы. Для получения градиента готовят два водных раствора сахарозы-— 15%-ный и 30%-ный (по весу). Их смешивают очень осторожной медленно, по каплям переливают в пластиковую центрифужную пробирку. Смешивание и переливание осуществляется с помощью прибора, показанного на рис. 15-10. Сначала пробирка заполняется 30% -ной сахарозой, но по мере того, как уровень жидкости В сосуде Б падает, туда поступает 15%-пая сахароза из сосуда А.

Смешивание приводит к постепенному уменьшению концентрации сахарозы. В результате в приборке образуется градиент плотности, увеличивающийся по направлению к дну.

Теперь нанесем сверху небольшую порцию раствора РНК. Если мы сделаем это очень осторожно, проба останется сверху в виде слоя, не смешивающегося с более плотным и вязким раствором сахарозы. После этого будем центрифугировать наш препарат с большой скоростью в течение многих часов. Высокомолекулярные РНК постепенно опускаются во все более плотные слои сахарозы.

Низкомолекулярные РНК остаются наверху или смещаются лишь немного. Молекулы РНК со,средними значениями молекулярного веса распределяются между ними. То же самое распределение можно" получить, если центрифугировать РНК в воде, но сахарозный градиент лучше выявляет различия в плотности молекул.

Каким образом определяют профиль РНК после центрифугирования? Дно пробирки осторожно прокалывают иглой. Содержимое пробирки по капле вытекает из отверстия, при этом не происходит заметного вертикального перемешивания и, следовательно, сохраняется распределение по размерам. Содержимое собирают каплю за каплей и определяют в нем РНК. РНК можно определять, используя ее способность поглощать свет с длиной волны 2600 А. Чем больше в пробе содержится РНК, тем больше поглощается света. После измерения поглощающей способности проб можно измерить их радиоактивность.

На рис. 15-11 показано распределение но размерам общей РНК клетки и цитоплазматической фракции РНК. Характер распределения их по оптической плотности практически одинаков. Это связано с тем, что РНК клетки состоит на 90% из цитоплазматической и только на 10% из ядерной РНК. Основными компонентами (около 85%) цитоплазматической РНК являются 2 класса ри-босомных РНК—28S- и 18S-pPHK—и некоторое количество 4S-РНК. Однако следует обратить внимание на то, что профиль РНК, синтезированных в течение 1 ч инкубации с 3Н-уридином, резко отличается от профиля общей РНК ( рис. 15-11, А). Эта РНК очень гетерогенна по размеру, но почти вся она высокомолекулярна. (