ься дальнейшим превращениям и служить источником энергии и питания, необходимых для роста.

Е. coli сталкивается с лактозой лишь случайно (в природе лактоза в основном встречается в молоке млекопитающих), и поэтому фермент jj-галактозидаза необходим бактерии только изредка.-. Если бы бактерия синтезировала этот фермент постожно, это приводило бы к лишним затратам энергии и питательных веществ. Но бактерии синтезируют jj-галактозидазу только в те моменты, когда в окружающей среде присутствует лактоза и некоторые другие близкие к пей соединения. Принято говорить, что синтез фермента индуцируется лактозой, т. е. лактоза является индуктором, а сам процесс получил название индукции ферментов.

Является ли индукция ферментов характерной для всех микроорганизмов? Весьма вероятно. Е. coli, например, может использовать другие 6-углеродные сахара — фруктозу, сорбозу, маннозу и т. д.; 5-углеродпые сахара — ксилозу, арабипозу, рибозу; диса-хариды и трисахариды — мальтозу, мелибиозу, раффинозу и сахарозу; полисахариды — крахмал и гликоген. Необходимый для роста азот кишечная палочка может получать из глутамиповой кис-, лоты, аммиака, нитрита, нитрата или мочевипы. Когда в естественных условиях обитания организм постоянно находит определенное питательное вещество, то ферменты, необходимые для его использования, синтезируются постоянно и соответственно всегда присутствуют в организме. Когда питательное вещество организм встречает редко, фермент (или ферменты), необходимый для его преобразования до привычных для организма соединений,, образуется путем индукции ферментов. Это относится не только к Е. coli, но также и к другим бактериям, дрожжам, плесневым грибам и до некоторой степени даже к клеткам растений и животных.

Расщепление при добавлении воды

Катализируется р-галактози-дазой

Глюкоза

Галактоза

Сколько Б. coli синтезирует р-галактозпдазы, из чего и с какой скоростью? Из Е. coli выделили р-галактозидазу, очистили ее и исследовали. Оказалось, что это достаточно большая молекула с молекулярным весом около 600 ООО дальтон. В популяции клеток Е. coli, обитающих в среде, лишенной лактозы, в среднем приходится только по одной-две молекулы Р-галактозидазы на клетку. После того как бактерии выдерживают в среде с индуктором в ус0 5 10 15

Ышиты

Рис. 4-2. Синтез р-галактозидазы в присутствии индуктора.

1 — индуктор присутствует постоянно, 2 — индуктор удален через 3 мин. Стрелкой указан момент добавления индуктора.

ловиях, обеспечивающих реализацию всех возможностей клетки синтезировать фермент, в среднем на клетку приходится 5000 молекул, что составляет 5 % от общего белка Е. coli.

На рис. 4-2 показана скорость синтеза р-галактозидазы. В самом начале опыта (по горизонтальной шкале — точка 0) в быстрорастущую культуру клеток-2?. coli добавили индуктор. Каждую минуту брали пробу клеток и измеряли содержание фермента в них. Через 3 мин после добавления индуктора культуру клеток разделили на две части: одну культивировали в тех же условиях, а другую — без индуктора (клетки собрали, отфильтровав среду через мелкопористый фильтр, и ресуспензировали в свежей среде без индуктора) . После этого в каждой культуре клеток определяли динамику накопления фермента.

Сразу же после внесения в среду индуктора уровень р-галактозидазы не изменился, но через несколько минут она начала накапливаться, причем с самого начала с максимальной скоростью. Еели индуктор оставался в среде, то синтез фермента продолжался. Если же индуктор удаляли через 3 мин, фермент продолжал накапливаться в среде в течение приблизительно 7—8 мин, причем скорость синтеза все время убывала, а затем синтез прекращался, р-галактозидаза, синтезированная до удаления индуктора, остается и, поскольку клетки продолжают делиться, распределяется между дочерними клетками (т. е. каждая дочерняя клетка получает от материнской половину цитоплазмы и соответственно половину р-галактозидазы). В результате количество р-галактозидазы в расчете на клетку быстро и непрерывно уменьшается. Приблизительно после десяти делений уровень р-галактозидазы возвращается к исходному: на клетку приходится 1—2 молекулы фермента.

В только что рассмотренных экспериментах (рис. 4-2) измеряли активность р-галактозидазы, т. е. ее способность действовать на субстрат и превращать его в определенный продукт В связи с этим возникает вопрос: может быть, до добавления индуктора вся р-галактозидаза уже была в клетке, но в неактивном состоянии, а роль индуктора заключается только в превращении неактивной формы фермента в активную? Чтобы зто выяснить, поставили следующий эксперимент.

1 Для измерения в клетке активности р-галактозидазы в качестве субстрата используют не лактозу, а один из аналогов лактозы — нитрофенил-р-галактозид (НФГ). В этом соединении с 4-м атомом углерода галактозы связан нитрофенил.. Подобно лактозе, НФГ можно расщепить добавлением воды, при этом образуются нитрофенол и галактоза. Нитрофенол светло-желтого цвета, а НФГ — бесцветный. Скорость расщепления НФГ р-галакто-зидазой обычно определяют с помощью калориметра по скорости окрашивания раствора в желтый цвет. Скорость этой реакции пропорциональна концентрации добавленного фермента, и поэтому ее используют для измерения концентрации фермента. Эти измерения нельзя проводить на интакт-ных клетках, так как через клеточные мембраны НФГ проникает недостаточно быстро. Поэтому вначале клетки разрушают механическим или химическим способом и для определения берут известное количество бескЛеточ-ной фракции.

В культуру одновременно с индуктором были добавлены меченые аминокислоты. Через определенное время собрали клетки, разрушили их и выделили в чистом виде р-галактозидазу. Оказалось, что р-галактозидаза, очищенная от всех других белков, содержит меченые аминокислоты. На этом основании можно сделать вывод о том, что по крайней мере некоторое количество фермента было синтезировано после того, как в среду культивирования были внесены индуктор и меченые аминокислоты. Сколько же при этом синтезировалось р-галактозидазы? На этот вопрос удалось ответить после проведения следующего эксперимента. Клетки выращивали в среде с мечеными аминокислотами без индуктора. Затем непосредственно перед внесением индуктора меченые аминокислоты были удалены и замещены немечеными. Спустя некоторое время клетки собрали, разрушили их и выделили в чистом виде р-галактозидазу. Оказалось, что фермент не содержит измеримых количеств меченых аминокислот. Итак, весь фермент синтезировался после введения в среду культивирования индуктора и удаления радиоактивных аминокислот.

В, заключение еще раз подчеркнем следующее. Синтез фермента начинается через несколько минут после добавления индуктора Я прекращается через несколько минут после его удаления. Синтез фермента идет с самого начала — с аминокислот; весь фермент синтезируется после внесения индуктора в среду культивации. В клетке может синтезироваться относительно много р-галактозидазы — 5 % от общего белка клетки.

Индуктором служит только одна лактоза? Нет, не только. Еслич аналоги лактозы (подобно НФГ) могут служить субстратом для Р-галактозидазы, т. е. могут расщепляться с помощью этого фермента, то они могут и индуцировать его синтез. Однако ситуация сложнее. Некоторые аналоги являются хорошими субстратами, но плохими индукторами, а другие — хорошие индукторы — совсем не расщепляются ферментом. Например, метилтиогалактозид— р-галактозид, в котором глюкоза замещена метильной группой (СН3~), а атом кислорода, соединяющий глюкозу с галактозой, . замещен атомом серы, — является лучшим индуктором, чем лактоза, но р-галактозидаза совсем не расщепляет его.

Где действует индуктор? В предыдущих экспериментах показано, что новый фермент синтезируется после того, как клетка подверглась действию индуктора. Как было показано в третьей главе, для синтеза белка необходимо: 1) транскрипция гена с образованием мРНК и 2) трансляция мРНК в соответствующий белок в бе-локсинтезирующей системе. Возникает вопрос: стимулирует ли индуктор образование мРНК или способствует ее трансляции? Ответ: индуктор стимулирует образование мРНК. Для того чтобы показать это, мы использовали мутантную линию Е. coli, у которой на-1 рушены две существенные функции. Этот мутант не может синтезировать РНК, если в среде отсутствует пиримидин урацил (собственный урапдл клетки не создают), и не может синтезировать белок, если в среде отсутствует аминокислота аргинин (собственный аргинин клетки также не образуют). Культуру клеток такого мутанта Е. coli, растущего на глюкозе (соответственно лишенных Р-галактозидазы), разделили на три части. К одной (А) на 3 мин добавили индуктор и аргинин, но не добавили урацил. Следовательно, в этой культуре мутант мог бы синтезировать белок, но пе РНК. Ко второй (Б) на то же время добавили индуктор и урацил, но не аргинин. Следовательно, мутант мог синтезировать РНК, но не белок. К третьей культуре (В) на три минуты добавили индуктор, урацил и аргинин, создав условия для синтеза как РНК, так и белка. Через 3 мин клетки во всех вариантах опытов собрали и удалили индуктор. Затем их перенесли в свежие среды с урацилом

дит, через несколько минут должно прекратиться и образование фермента.

Как действует индуктор и на что он действует? Было выделено много мутантных линий Е. coli, которые по отношению к лактозе ведут себя иначе, чем родительская линия. Эти мутации можно распределить па две группы.

1. Мутации структурного гена; у мутаптов структура Р-галактозидазы отличается от структуры родительского фермента, т. е. имеются различия в аминокислотной последовательности.

2. Мутации гена регулятора; у мутантов (З-галактозидаза по структуре не отличается от исходной родительской формы, но синтезируется либо слишком много, либо слишком мало фермента, или синтез фермента осуществляется в отсутствие индуктора, или наоборот — фермент не синтезируется и в присутствии индуктора.

ДНК

Белок-репресеор (р^-"""

о

ДИК

мРНК ЧАЛААУ

Л/\Л/УУ\ГмРНК

репрессор (?) ^ /К.

Индуктор

0^

(^) р-галактозидаза

Рис. 4-4.