ись пи крысы, ни их печень, а были использованы клетки опухоли пеРис. 4-9. Синтез тирозинаминотрансферазы в клетках животпых,

индуцированный гормоном.

1 — гормон присутствует все время, 2 — гормон отсутствует. Стрелков, направленной вниз, указан момент добавления гормона в популяцию клеток гепатомы; стрелкой, направленной вверх, — момент удаления

гормона.

чепи крысы (гепатомы). Суспензия диспергированных клеток гепатомы может расти вне организма, совсем как микроорганизмы (в гл. 6 дано детальное описание методов культивирования клеток животных и растительных организмов), но при этом клетки все еще отвечают на действие гормона, подобно обычным печеночным клеткам. Реакция клеток гепатомы показана на рис. 4-9.

Внешне эти изменения соответствуют явлению индукции ферментов у бактерий, т. е. добавление индуктора запускает синтез фермента, удаление индуктора останавливает его и в конце концов количество фермента в клетке возвращается к исходному уровню. Однако в действительности это явление отличается от индукции ферментов у бактерий во многих отношениях. Например:

1. Индуктор — стероидный гормон — не является субстратом для фермента и не сходен с тирозином. До сих пор не известны ни место действия гормона (поверхность клетки, цитоплазма или ядро), ни механизм его действия.

2. Фермент непрерывно и с очень значительной скоростью разрушается клетками. Таким образом, уровень тирозинаминотранс-феразы в клетках отражает соотношение между синтезом и распадом белка. В клетках, не подвергавшихся действию гормона, синтез аминотрансферазы лишь слегка превышает ее деградацию.

Ген

тирозинаминотрансферазы

Активный, фермент

Рис. 4-10. Предполагаемый механизм индуцированного синтеза

тирозинаминотрансферазы.

J. То, что в действительности измеряется. 11. Для этой стадии необходима транскрипция и трансляция. Какого гена? Что при этом образуется? Как работает ген? 111. Какова степень деградации? Образуется белок меньшего размера и другой функций или распад идет до аминокислот? IV. Гормон действует, вероятно, на этой стадии."Прямо или опосредованно? Каков механизм?

Следовательно, когда клетки растут и делятся, активность аминотрансферазы в них поддерживается на невысоком, но устойчивом уровне. При добавлении гормона скорость синтеза фермента увеличивается в 20 раз, а скорость его распада остается прежней. В результате величина активности фермента на клетку увеличивается в 20 раз. При удалении гормона скорость синтеза снижается до исходного значения и высокий уровень активности не может поддерживаться. Белки у бактерий также разрушаются, но обычно скорость распада слишком мала, чтобы существенно влиять на уровень активности ферментов.

3. Гормональный индуктор, по-видимому, не влияет на синтез специфической мРНК для аминотрансферазы. Гормон, вероятно, регулирует скорость трансляции этой мРНК в активный фермент.

4. Деструкция аминотрапсферазы пе пассивное неспецифическое явление — для разрушения фермента также необходима транскрипция. Если блокировать синтез РНК (и белка), то ами-потрансфераза не разрушается.

Регуляции синтеза и распада тирозинаминотрапсферазы представлена схематически на рис. 4-10.

Изменение активности белка как проявление физиологической модуляции

Физиологические реакции клетки можно модулировать, изменяя не только скорость синтеза и деструкции белков, но и биологическую активность одного или нескольких белков. Рассмотрим следующие примеры.

Ингибировачше активности фермента конечным продуктом. Если клетки Е. coli получают глюкозу и аммиак, они могут синтезировать аспарагиновую кислоту. Аспарагиновая кислота в свою очередь является исходным продуктом для синтеза треонина, а треонин служит предшественником изолейцина (рис. 4-11). Все три аминокислоты очень важны, и без них ни Е. coli, ни любая другая клетка расти не сможет.

Превращение треонина в изолейцин осуществляется в пять последовательных этапов. Первый из них катализируется ферментом треониндезаминазой. Этот фермент может распознавать и специфически связываться с двумя разными соединениями — треонином, со своим обычным субстратом, и с изолейцином, конечным продуктом реакции. Каждое из этих соединений связывается с определенным участком фермента. Когда фермент связан с изолейцином, его форма меняется так, что он уже не может соединиться с треонином, т. е. не может выполнять функции фермента. Это подавление обратимо, поскольку после удаления изолейцина активность фермента полностью восстанавливается.

К чему же это приводит? В живой клетке изолейцин, ингиби-руя активность треониндезамипазы, может выключить свой собственный синтез. В норме скорость синтеза и использования изолейцина одинакова. Таким образом, концентрация изолейцина очень низка, активность треониндезамипазы не меняется, синтез лзолейцина происходит с максимальной скоростью. Если бы по какой-то причине изолейцип накапливался в клетках, то активность треониндезаминазы была бы подавлена, вследствие этого снизился бы или полностью прекратился дальнейший синтез изолейцина. (Накопление изолейцина может произойти либо благодаря поступлению аминокислоты из окружающей среды, либо из-за прекращения роста клеток, когда запасы изолейцина не используются для синтеза белка.) Поскольку подавление обратимо, возможна очень тснкая регуляция синтеза белка.

Эта система увеличивает производительность бактерий; они расходуют энергию и сырьевые запасы для синтеза изолейципа только тогда, когда это необходимо. Следует обратить внимание на

ТХюкоэа

Несколько промежуточных реакций

Аспараги-новая кислота

|хон нсн (

I //

н н \

Q ^зеониндезаминаза ^

Ацетооксимасляная кислота

Диоксиизолейцин

СС-Кетоизолейцин

н

сн н

н

нс-сн н

Иэолейцин

HN — С

н н

У/

он

Рис. 4-1 i. Регуляция конечным продуктом синтеза изолейцина у

Е. coli.

то, что из всех Пяти промежуточных реакций биосинтеза изолейцина регулируется только первая реакция, причем так, что она не мешает осуществлению других реакций. Подобным образом конт

ролируется синтез мпогих метаболитов не только у Е. coll, но и у других микроорганизмов, а также- в растительных и животных клетках.

Множественные формы фермента — еще одна возможность-проявления модуляций. На рис. 4-12 показаны пути биосинтеза двух аминокислот — треонина и лизина, исходным продуктом для которых служит аспарагиновая кислота. Первые три реакции для

Аспарагиновая кислота

Асгшрпшкинша

Аспартилкитэа

Аспартилфюсфат

Аспартилпслуальдегид

Лизин ингибир^ует

Треонин ингиШрует 0)

'них общие, но затем па уровне одного из промежуточных соединений — гомосерина — пути биосинтеза расходятся. Избыточное количество треонина подавляет реакцию в точке а по типу обратной связи. Подавление продолжается до тех пор, пока избыток треонина не израсходуется на синтез белка или не превратится в изолейцин. Наоборот, присутствие избыточного количества лизина приводит к подавлению в точке а1 также по типу обратной связи. Существование двух разных точек контроля дает клетке возможность регулировать синтез треонина и изолейцина, не нарушая синтеза лизина, и наоборот.

Но тут же возникает другая проблема. Подавление синтеза треонина в точке а привело бы к синтезу слишком большого количества лизина, поскольку избыток гомосерина больше некуда было

бы использовать. Чтобы это предотвратить, клетка регулирует также образование гомосерина. Осуществляется регуляция следующим образом. В клетке существуют 2 фермента: аспартилкина-зы I и II, катализирующие первую реакцию биосинтеза. Один ин-гибируется избытком треонина, а другой — избытком лизина. Эти дополнительные точки модуляции (б чи б1) обеспечивают контролируемое участие промежуточных соединений в последующих реакциях. Аспартилкиназы являются продуктами двух разных структурных генов.

йюкоза

Катализируется ЛДГ

1 I

со2 +

НС — он

Молочная кислота

|чон с=о

нсн н

В отсутствие кислорода

В присутствие-кислорода

Пировиноградная кислота

Рис. 4-13. Окисление дировиноградной кислоты в присутствии и

в отсутствие кислорода.

Изоферменты лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и регуляция их активности. При окислении глюкозы ключевым промежуточным соединением является пировиноградная кислота. Окислительная реакция происходит с выделением водорода, а весь процесс может быть записан следующим образом: глюкоза (СбН^Об—>-2 молекулы пировиноградной кислоты (G3H4O3) + 4Н. Для того чтобы реакция продолжалась, необходимо связать водород. В присутствии кислорода не возникает проблем, поскольку 4Н + Ог = 2НгО и пировиноградная кислота может подвергаться дальнейшему окислению до С02 и Н20. Итак: СбН^Ое + бОг—>-6С02 + 6Н20. В отсутствие кислорода акцептором водорода должно служить другое вещество. Столь разнообразные клетки, как бактерии Streptococcus lactis и мышечные клетки высших животных, в качестве акцептора водорода используют саму пировипоградную кислоту, Как показано па рис. 4-13, пировиноградная кислота при этом превращается в молочную кислоту. Фермент, катализирующий эту реакцию, называется лактатдегидрогеназой (ЛДГ).

У всех высших животных ЛДГ, выделенная из мышцы сердца, четко отличается от ЛДГ из скелетной мышцы. ЛДГ скелетной мышцы обеспечивает ее напряженную работу в условиях недостатка кислорода. При этом быстро накапливается лактат. Сердце получает достаточно кислорода и, как правило, работает равноРис. 4-14. Изоферменты лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

При электрофорезе в крахмальном геле выявляются пять типов ЛДГ (показаны слева).- Все они являются тетрамерами, в состав которых входят две субъединицы в равных пропорциях (показаны справа). Полосы выявляются при окрашивании на белок. Стрелкой указан

старт.

мерно. Основная задача ЛДГ сердечной мышцы — избавиться от образующегося лактата, вновь окисляя его до пирувата. Каталитические свойства ЛДГ отражают эту функцию.

Все формы ЛДГ независимо от того, какая ткань является ее источником, представляют собой полимеры, состоящие из четырех полипептидных субъединиц. В водном растворе удается диссоциировать очищенный фермент на субъед